行為學研究乳清蛋白肽對衰老小鼠學習記憶的影響

齊微微，卞輯，蔡興航，郭佩佩，王艷菲，姚宇秀，于國萍

（東北農業大學食品學院，哈爾濱150030）

0 引言

近年來人們對乳清蛋白肽[1]的研究逐漸成為熱點，目前已發現某些肽段具有抗氧化，降血壓[2]，降膽固醇，增強免疫力，抗毒，抗病菌[3]等多種生理功能，E.A.Pera-Ramos等研究發現乳清蛋白酶解物在脂質氧化體系中可以防止脂質過氧化[4]。Tugba Bayr[5]等酶解乳清蛋白，研究了其自由基清除能力，發現乳清蛋白肽具有良好的抗氧化活性；包怡紅等[6]證實以全乳清為原料，利用堿性蛋白酶對乳清蛋白進行降解，水解后的多肽對Fenion體系產生的羥自由基有清除能力。目前已經證實乳清蛋白肽能夠清除自由基[7]，延緩機體衰老，因而可能也具有改善學習記憶的作用，但研究并不多見。本實驗選擇抗氧化活性最強的乳清蛋白肽的超濾組分進行動物行為學實驗，研究乳清蛋白肽對衰老小鼠學習記憶能力的影響。

1 實驗

1.1 材料與試劑

濃縮乳清蛋白（WPC 80），蛋白質質量分數78.29%，堿性蛋白酶（1.75×105U/g），昆明種雌雄小鼠，吡拉西坦（腦復康，0.4 g×100片），其余所有試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

UVmini-1240紫外可見分光光度計，LD4-2A型低速離心機，萬能粉碎機，RE-52型旋轉蒸發儀，DSM-2型Morris水迷宮系統與SCS-2型程控小鼠穿梭箱，DT-200小鼠跳臺測試儀。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白抗氧化肽的制備

乳清蛋白肽的制備參考卞輯的方法[8],以DPPH自由基清除率為指標，對乳清蛋白肽進行脫鹽、超濾分離，篩選出抗氧化活性最高的組分（分子量小于3 ku），將其冷凍干燥成粉末，以備下一步實驗。

1.3.2 動物行為學實驗

1.3.2.1 實驗動物飼養及分組

動物飼養：取雌雄昆明種小鼠80只，購買自然衰老的老年小鼠16～18月齡，青年小鼠3月齡，體重20.0g±2.0 g，適應性飼養1周后，用Morris水迷宮系統篩選，剔除漂在水面上的小鼠，剩余72只。隨機分組（見表1），每組雌雄小鼠數目相等，分為青年對照組，老年模型組，腦復康對照組和乳清蛋白肽低、中、高劑量組，分籠飼養，雌雄不同籠。每組12只，每5天稱1次體質量，老年模型組和青年對照組每天注射等量生理鹽水。低、中、高劑量組注射的乳清蛋白肽溶液是由超濾分離出的分子量小于3 ku的寡肽凍干粉配制而成。

表1 動物實驗分組方案

1.3.2.2 行為學實驗

連續喂養30 d后，于第31天按照跳臺實驗、穿梭箱實驗、水迷宮實驗的順序依次開始行為學實驗。

（1）跳臺實驗[9]。實驗時先將小鼠放入反應箱內（臺上、臺下）適應環境3 min，然后將其放在銅柵上，立即通以36 V的交流電，觀察小鼠受到電擊跳回平臺以及再次跳至銅柵上的情況。如此訓練5 min，記錄每只小鼠受電擊的次數或稱錯誤次數（EN1），以此作為學習成績。24 h后和5 d后分別進行重復測驗，將小鼠置于平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的時間，即停留潛伏期（step-down latency，SDL）和各鼠3 min內的錯誤次數（EN1），以此作為記憶成績。停止實驗5d后再進行1次重復實驗，記錄上述指標，作為記憶消退階段的成績。

（2）穿梭箱實驗[10-11]。實驗時將小鼠放入穿梭箱內任何一側，10 s后開始出現蜂鳴音，持續5 s，蜂鳴音后給予電刺激（100 V，0.2 mA，50 Hz，AC），持續10 s。連續訓練4 d，每天10次。記錄以下指標：電擊時間，即動物被電擊的累計時間；電擊次數，即在10個循環中小鼠被電擊到的次數。

（3）Morris水迷宮實驗[12-13]。實驗時將平臺隨機置于第一象限并固定于水下1～1.5 cm，水溫保持在21℃±1℃。整個實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。

①定位航行實驗：用于測量小鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，實驗歷時6 d，每天訓練4次。在距離平臺所在象限的較遠象限的水池壁上標定一點，作為實驗小鼠的入水點，實驗過程保持站臺位置和小鼠落水位置不變。將小鼠沿水池壁慢慢放入水中，通過Dig Behv-MWM視頻分析系統記錄小鼠從投入水池至找到并爬上平臺的時間，此為定向航行實驗逃逸潛伏期，同時記錄游泳路程、游泳速度和朝向角，以此作為評價大鼠學習能力差異的指標，每次觀察時間為90 s，若設定時間內未找到站臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為90 s，然后通過引導使小鼠游上平臺并停留5s。每次試驗均在安靜的環境中進行，水池和光源的位置應保持不變。

②空間探索實驗：用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力，方法為第七天撤去平臺，以訓練時的標定點作為入水點，將小鼠放入水中，記錄120 s內小鼠在目標象限（平臺所在象限）的停留時間、目標象限停留路程、準確穿越平臺所在位置的次數及初次穿越平臺時間等指標，作為空間搜索試驗的成績，以此來判斷小鼠對空間位置的短期記憶和判斷能力。

1.4 統計分析

文中數據均使用SPSS18.0軟件進行統計分析，所用數據均為三次的平均數，誤差項為標準誤，單因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan檢驗。文中采用Sigma Plot 9.0軟件作圖，圖表中標有相同字母者為差異不顯著，有不同字母者為差異顯著（P≤0.05）。

2 結果與分析

2.1 跳臺實驗測試結果

表2為乳清蛋白肽對跳臺潛伏期和跳臺錯誤次數的影響。由表2可以看出，與老年模型組相比，學習5 min后，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽劑量組錯誤次數顯著減少；24 h后重復測驗結果顯示，乳清蛋白肽中、高劑量組的潛伏期顯著增加，錯誤次數顯著減少，乳清蛋白肽低劑量組的潛伏期無顯著變化，錯誤次數顯著減少；5 d后重復測驗結果顯示，乳清蛋白肽中、高劑量組的潛伏期和錯誤次數變化與24 h相同，而低劑量組的潛伏期和錯誤次數均無顯著變化。與青年對照組和腦復康對照組相比，學習5 min后，乳清蛋白肽劑量組的錯誤次數顯著增加；24 h后重復測驗結果顯示，乳清蛋白肽劑量組的潛伏期顯著減少，錯誤次數顯著增加；5 d后重復測驗結果與24 h變化規律一樣。

表2 乳清蛋白肽對跳臺潛伏期和跳臺錯誤次數的影響（n=10）

結果表明中、高劑量組乳清蛋白肽可以提高衰老小鼠的被動回避反應能力，高劑量組效果最好，低劑量組的效果不明顯。

2.2 避暗實驗測試結果

圖1 乳清蛋白肽對電擊時間和電擊次數的影響

圖1為乳清蛋白肽對電擊時間和電擊次數的影響。由圖1可以看出，隨著訓練天數的增加，各組小鼠的電擊時間和電擊次數均顯著減少，說明小鼠的躲避能力有所增強；采用Duncan法對各組的指標進行兩兩比較發現，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽中、高劑量組的電擊時間和電擊次數均顯著減少，乳清蛋白肽低劑量組的電擊時間也顯著減少，但電擊次數無顯著變化；與此同時，與青年對照組和腦復康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組的電擊時間和電擊次數均顯著增加。說明一定劑量的乳清蛋白肽雖可以提高衰老小鼠的避暗能力，但與青年和腦復康對照組相比還有一定差距。

2.3 水迷宮實驗測試結果

2.3.1 定位航行實驗

圖2為乳清蛋白肽對水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影響。

由圖2可以看出，時間與組間無交互作用；隨著訓練天數的增加，各組動物的逃避潛伏期、游泳路程和朝向角均顯著減少，游泳速度顯著增加，說明經過6天訓練，小鼠的學習能力均有不同程度的增強。采用Duncan法對各組的指標進行兩兩比較發現，隨著訓練天數的增加，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽劑量組的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角顯著減少；但分別與青年對照組和腦復康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組的逃避潛伏期、游泳路程仍有顯著增加，游泳速度和朝向角雖然個別數值有些波動，但整體趨勢有所增加，且各組之間均存在顯著性差異。說明乳清蛋白肽在一定程度上能夠改善衰老小鼠的學習能力。

2.3.2 空間探索實驗

實驗第7天，撤去平臺后進行空間探索實驗，結果如表3所示。由表3可以看出，與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽劑量組在目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數均顯著增加；初次穿越平臺的時間顯著減少；乳清蛋白肽低、中劑量組在目標象限停留路程增加；青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽高劑量組在目標象限停留路程減少；分別與青年對照組以及腦復康對照組相比，乳清蛋白肽劑量組在目標象限停留時間、時間百分比、路程百分比、經過平臺次數顯著減少；目標象限停留路程、初次穿越平臺的時間顯著增加；且各組之間均存在顯著性差異，與乳清蛋白肽呈良好的量效關系，說明乳清蛋白肽能夠改善衰老小鼠的空間記憶能力。

2.3.3 水迷宮游泳軌跡類型

搜索策略是衡量動物分析判斷能力和解決問題能力的指標。水迷宮游泳軌跡如圖3所示，圖3中，小鼠的搜索策略隨著訓練次數的增加而呈現“邊緣式→隨機式→趨向式→直線式”的變化規律，學習記憶能力好的小鼠，經過3～5 d的訓練，其搜索策略以趨向式和直線式為主（統稱為空間策略），而較差的則以邊緣式和隨機式為主。

表3 乳清蛋白肽對第7天空間探索實驗的影響 （n=10）

圖2 對水迷宮逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角的影響

在定位航行與空間探索實驗中，每組10只小鼠，共游泳280次，搜索策略結果顯示（表4），老年模型組游泳軌跡以隨機型和邊緣型為主，共188次，說明需要較長時間和游泳路程才能找到平臺；與老年模型組相比，青年對照組、腦復康對照組和乳清蛋白肽劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所增加；分別與青年對照組相比以及與腦復康對照組相比，乳清蛋白肽低、中劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所減少，乳清蛋白肽高劑量組的趨向型和直線型軌跡總數有所增加，說明衰老小鼠的空間學習和記憶保持能力得到明顯改善。這可能是由于乳清蛋白肽具有抗氧化活性，可以清除腦內自由基，阻止脂質過氧化反應的發生，降低過氧化物的生成，從而延緩大腦的衰老，對學習記憶力具有一定改善作用。

圖3 水迷宮游泳軌跡

表4 乳清蛋白肽對水迷宮游泳軌跡的影響

3 結論

在跳臺和穿梭箱實驗中，乳清蛋白肽灌胃后可以增加衰老小鼠跳臺潛伏期和減少跳臺錯誤次數，減小電擊時間和電擊次數，其中中、高劑量組效果顯著；在水迷宮實驗中，從整體趨勢上看，乳清蛋白肽灌胃后可以減少定位航行實驗中衰老小鼠的逃避潛伏期、游泳路程、游泳速度和朝向角，增加空間探索實驗中的目標象限停留時間、目標象限停留時間百分比、目標象限停留路程百分比、經過平臺次數和減少初次穿越平臺的時間，同時游泳軌跡也向趨向型和直線型發展，可見乳清蛋白肽能夠提高衰老小鼠的被動回避和空間學習記憶能力。

但是本研究制備的乳清蛋白抗氧化肽對行為學的影響目前仍不如腦復康等西藥，與青年小鼠相比也尚存在一定差距，也許可以通過改進制備方式純化方法等，獲得具有功能性質效果更好的乳清蛋白肽，因此，在乳清蛋白肽功能特性的開發和利用，以及其對行為學的影響上，還需要進一步的研究。

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