結核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值評估

袁秀麗

（山東省臨沂市人民醫院東醫療區內科三病區，山東 臨沂 276034）

·論著·

結核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值評估

袁秀麗

（山東省臨沂市人民醫院東醫療區內科三病區，山東 臨沂 276034）

目的評估結核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值。方法選擇結核性腦膜炎患者58例作為觀察組，取同期原發性頭痛患者60例作為對照組，檢測兩組患者的血漿及腦脊液miRNAs含量，IL-6及IFN-γ水平，進一步分析miRNAs含量與IL-6、IFN-γ水平的相關性。結果觀察組患者的血漿及腦脊液中miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144含量明顯高于對照組患者（P＜0.05）；血漿及腦脊液中IL-6、IFN-γ水平低于對照組患者（P＜0.05）；miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達量與血清IL-6、IFN-γ水平呈負相關（P＜0.05）。結論結核性腦膜炎患者的miRNAs表達異常，一定程度上抑制機體免疫反應、增強病原體毒性，其水平及終端炎癥因子水平的測定可以用于患者病情的判斷。

結核性腦膜炎；miRNAs；IL-6；IFN-γ

結核性腦膜炎起病隱匿，臨床表現不明顯，許多患者延誤最佳治療時機導致病情逐步加重，致殘率及致死率均較高。以往結核性腦膜炎的診斷主要依靠病原體檢測，但是存在檢測周期長、靈敏度低等缺陷，關于該病的快速有效的診斷手段探索一直是臨床研究的重點。微RNAs（microRNAs，miRNAs）近年來成為一種新型的疾病診斷標志物，關于肺結核患者的體液中miRNAs表達的研究已經開展較多，但是關于結核性腦膜炎患者的體液中miRNAs表達情況及其對疾病診斷的意義報道較少[1]。本次研究主要評估評估結核性腦膜炎患者血漿和腦脊液中miRNAs含量檢測及其臨床價值。具體匯報如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

研究對象取自2012年11月-2014年11月在本院治療的頭痛患者，其中，結核性腦膜炎患者58例作為觀察組，均經結核DNA檢測陽性。其中，男性30例，女性28例；年齡33～67歲，平均（46.18± 8.93）歲，體重48～72 kg，平均（64.92±5.33）kg；原發性頭痛患者60例作為對照組，體格檢查未發現陽性體征，同時腦脊液檢測各項指標值均在正常范圍內。其中，男性32例，女性28例；年齡35～65歲，平均（47.82±7.81）歲，體重46～73 kg，平均（63.78± 5.29）kg。所有入組患者均簽署知情同意書，研究方案經倫理委員會批準通過，兩組患者的基線資料差異無統計學意義（P＜0.05），具有可相比。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本收集抽取所有研究對象的外周靜脈血2 ml，同時經腰椎穿刺收集腦脊液3 ml，樣本在采集3 h內進行離心，取上清置于無酶凍存管內，-80℃冰箱內凍存備用。

1.2.2 miRNAs含量的PCR檢測采用miRNA提取試劑盒抽提結核性腦膜炎患者血漿和腦脊液的總miRNA，使用加尾反轉錄試劑盒將miRNA反轉錄為對應的cDNA；取cDNA標本進行PCR擴增，正向miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144引物及反向通用引物均由天根公司提供，以U6為內參照對miRNA-21的含量進行半定量分析。

1.2.3 ELISA檢測將樣本取出4℃冰箱內融化，采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定其中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）水平，具體操作步驟及注意事項按照說明書進行。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析，兩組間計量資料采用t檢驗，相關性分析采用一元線性回歸，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿miRNA水平

觀察組患者的血漿miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達量明顯高于對照組患者（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者的血漿miRNA水平比較

2.2 腦脊液miRNA水平

觀察組患者的腦脊液miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達量明顯高于對照組患者（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者的腦脊液miRNA水平比較

2.3 血漿及腦脊液炎癥因子水平

觀察組患者的血漿及腦脊液IL-6、IFN-γ水平均顯著高于對照組患者（P＜0.05），見表3。

2.4 miRNA表達與炎癥因子水平的相關性

經一元回歸分析，觀察組患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達量與血清IL-6和IFN-γ水平呈負相關（P＜0.05），見表4。

表3 兩組患者的血漿及腦脊液炎癥因子水平比較（pg/ml±s）

表3 兩組患者的血漿及腦脊液炎癥因子水平比較（pg/ml±s）

組別IL-6IFN-γ血漿血漿腦脊液觀察組93.66±10.53 78.26±9.2727.95±2.1511.67±1.72對照組9.17±0.756.35±0.5310.72±0.853.72±0.51 t值10.2411.827.098.18 P值0.0100.0090.0190.015腦脊液

表4 miRNA表達與炎癥因子水平的相關性

3 討論

結核病是一個世界性的重大挑戰，據統計目前全球每年新增活動性結核病患者約800萬，并有約140萬人死于該病。結核分枝桿菌感染的具體分子機制目前尚未闡明，許多耐藥及泛耐藥結核分枝桿菌的出現更是給世界衛生安全帶來巨大威脅。microRNA（miRNA）是一類在轉錄后水平對基因表達起調控作用的單鏈非編碼RNA，長度為19～22個核苷酸，已經有研究證實miRNA在細胞的死亡、增殖、癌變等環節均發揮重要作用，miRNA表達失調與多種疾病發生包括病毒感染、肺部疾病、腫瘤等等密切相關[2]。關于miRNA與結核病之間的相關關系已經受到廣泛關注，miRNA芯片技術首次揭示了miRNA與肺結核的直接相關關系；HARAPAN[3]的研究表明活動性肺結核患者的痰液中存在miRNA的高表達，故有學者提出可以將miRNA作為結核病診斷的標志物以及治療的靶點。

目前的研究揭示miRNA可以參與免疫細胞的成熟分化及活化，其通過選擇性的表達、干擾甚至抑制靶基因mRNA，最終發揮調控免疫反應、免疫應答等作用。柴璐璐[4]在對活動性肺結核及健康人群的血清miRNA-155表達量進行對比后發現，肺結核患者的miRNA-155表達量增加約4倍，提示miRNA-155可能是活動性肺結核的潛在診斷標志。miRNA-29a是新近發現的與多種疾病發生關系密切的小分子RNA家族，其靶基因主要是細胞外基質及遷移蛋白，可以抑制多種膠原蛋白的表達，由于膠原蛋白的異常聚集是纖維化的基礎，故miRNA-29a在抗纖維化中發揮重要作用。同時miRNA是T細胞因子或者淋巴樣增強因子的負調控因子，可以通過靶向降解IFN-γ降低機體對病原體的免疫應答，通過目標基因IFN-γ來控制結核病的先天性及適應性免疫應答[5]。有研究顯示miRNA-144在結核病患者中表達量大增，其可以抑制TNF-α、IFN-γ產生以及T細胞增殖，進一步抵抗結合感染過程中機體的免疫力。miRNA-155時結核桿菌介導巨噬細胞凋亡的必須物質，有研究證實在敲除miRNA-155的大鼠中，結核分枝桿菌疫苗誘導的感染細胞凋亡受到抑制。miRNA-3179a也被認為是結核性腦膜炎的標志性miRNA，其水平高低與疾病嚴重程度密切相關[6]。上述研究結果顯示：觀察組患者的血漿及腦脊液中，miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a和miRNA-144表達量明顯高于對照組患者（P＜0.05），提示上述miRNA可以成為診斷結核性腦膜炎的特異性指標。

在結核分枝桿菌感染患者中，諸多miRNA表達量的上調伴隨著TNF-α、IFN-γ及IL-6等炎癥因子水平的分泌量改變，在本次研究的結果顯示：觀察組患者的血漿及腦脊液IL-6、IFN-γ水平均顯著高于對照組患者（P＜0.05），提示結核分枝桿菌感染患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144高表達可以阻斷炎癥介質表達，使結核分枝桿菌顛覆宿主免疫并增加其毒力，進一步加重病情并增加治療難度[7]。在進一步對miRNA與炎癥介質水平的相關性進行分析后得出結果：觀察組患者的miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-3179a及miRNA-144表達量與血清IL-6和IFN-γ水平呈負相關（P＜0.05），證實miRNA在結核分枝桿菌感染患者中通過參與介導免疫反應并影響炎癥反應來發揮對疾病轉歸的影響[8]。

綜上所述，筆者認為，結核性腦膜炎患者的血漿及腦脊液中miRNAs表達異常，一定程度上抑制機體免疫反應、增強病原體毒性，其水平及終端炎癥因子水平的測定可以用于患者病情的判斷及治療過程的指導。

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Detection of mirnascontentin plasma and cerebrospinal fluidin patients with tuberculous meningitis and its clinical value evaluation

Xiu-li YUAN
(Department of Inner Medicine,East Medical District of Linyi People's Hospital, Linyi,Shandong 276034,P.R.China)

【Objective】To evaluate miRNAs content in plasma and cerebrospinal fluid in patients with tuberculous meningitis and its clinical value.【Method】58 cases of patients with tuberculous meningitis were enrolled as observation group,60 cases patients with primary headache at same period were enrolled as control group.Then miRNAs,IL-6 and IFN-γcontents in plasma and cerebrospinal fluid were detected and the correlation of miRNAs content with IL-6,IFN-γ contents was further analyzed.【Results】miRNA-125b,miRNA-29a, miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents in plasma and cerebrospinal fluid of observation group were significantly higher than control group(P＜0.05);IL-6,IFN-γ levels in plasma and cerebrospinal fluid were higher than control group(P＜0.05);miRNA-125b,miRNA-29a,miRNA-155,miRNA-3179a,miRNA-144 contents were negatively correlated with serum IL-6,IFN-γ levels(P＜0.05).【Conclusion】miRNAs expression in tuberculous meningitis patients are abnormal and can inhibit immune response,enhance pathogen toxicity at some extent; determination of their level and terminal inflammatory factors levels of can be used for the judgment of disease.

tuberculous meningitis;miRNAs;IL-6;IFN-γ

R529.3

A

1005-8982（2015）31-0022-04

2015-03-21