促紅細胞生成素衍生肽抑制大鼠心肌微血管內皮細胞缺血再灌注損傷的作用研究*

王琛，司瑞，張明明，余文軍，郝啟萌，張榮慶，王海昌

促紅細胞生成素衍生肽抑制大鼠心肌微血管內皮細胞缺血再灌注損傷的作用研究*

王琛，司瑞，張明明，余文軍，郝啟萌，張榮慶，王海昌

目的：探討促紅細胞生成素衍生肽（HBSP）抑制大鼠心肌微血管內皮細胞（CMECs）缺血/再灌注損傷的作用及其機制。

方法：分離培養大鼠CMECs，建立缺血/再灌注損傷模型，隨機分為對照組、模擬缺血/再灌注組（SI/R組）、SI/R＋重組人促紅細胞生成素組（SI/R+rhEPO組）、SI/R＋HBSP組；HBSP分別選擇2.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml四個濃度，通過噻唑藍（MTT）比色實驗檢測CMECs增殖能力以確定藥物作用的最適濃度。而后采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力，末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定（TUNEL）法檢測細胞凋亡率來進一步驗證其保護作用。研究保護機制的實驗分組為：對照組、SI/R組、SI/R＋HBSP（HBSP最適濃度為25 ng/ml）組、SI/R+HBSP+磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制劑（LY294002）組、SI/R+HBSP+雷帕霉素組，采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測蛋白激酶B（AKT）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）等蛋白的表達及其磷酸化水平。

結果：與SI/R組比，SI/R+rhEPO組和SI/R+HBSP組CMECs增殖能力明顯上升（P＜0.05），凋亡率顯著下降（P＜0.01），遷移能力增強。用抑制劑LY294002及雷帕霉素處理后，與SI/R組相比，SI/R+HBSP組AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均顯著提高（P＜0.05）；與SI/R+HBSP組相比，SI/R+HBSP+LY294002組的AKT、mTOR及p70S6K的磷酸化水平均顯著下降（P＜0.05），SI/R+HBSP+雷帕霉素組mTOR磷酸化水平及p70S6K磷酸化水平顯著下降（P＜0.05）。

結論：HBSP能夠抑制缺血/再灌注誘導的CMECs的損傷，其保護作用可能與PI3K-AKT/mTOR信號通路激活有關。

促紅細胞生成素衍生肽；心肌微血管內皮細胞；缺血/再灌注損傷；細胞凋亡

Methods: The CMECs were isolated from SD rats to establish I/R model, and the cells were randomly divided into 4 groups: ①Control group, ②Simulated ischemia/reperfusion (SI/R) group, ③SI/R + rhEPO group, ④SI/R + HBSP group, in which the reperfusion medium contained HBSP at 2.5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml respectively. MTT method showed that HBSP 25 ng/ml was the best concentration to detect CMECs proliferation. The protective experiment was divided into 5 groups: ①Control group, ②SI/R group, ③SI/R + HBSP (25 ng/ml) group, ④SI/R + HBSP + PI3K inhibitor LY294002 group and ⑤SI/R + HBSP + Rapamycin group. The protein expressions of AKT, mTOR and p70S6K were examined by Western blot analysis.

Results:①Compared with SI/R group, SI/R + rhEPO group and SI/R + HBSP group had increased CMECs

proliferation, increased migration ability, P＜0.01 and decreased apoptosis rate, P＜0.01.②Compared with SI/R group, SI/R + HBSP group increased the phosphorylation level of AKT, mTOR and p70S6K, P＜0.05. ③compared with SI/R + HBSP group, SI/R + HBSP + PI3K inhibitor LY294002 group presented decreased phosphorylation level of AKT, mTOR and p70S6K, P＜0.05; SI/R + HBSP + Rapamycin group had decreased phosphorylation level of mTOR and p70S6K, P＜0.05.

Conclusion: HBSP may protect CMECs from I/R injury in experimental rats, which might be related to the activation of PI3K-AKT/mTOR signal pathway.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:280.)

心肌缺血/再灌注損傷（I/RI）是急性心肌梗死患者血管再通治療時常伴隨著的重要病理生理過程，不僅發生率高，而且影響血管再通治療效果，嚴重者甚至導致死亡。以往研究證實，促紅細胞生成素（EPO）除具有治療貧血作用外，還可對心臟、腎臟等重要器官發揮保護作用[1,2]。但發揮此保護作用需要給予較高濃度，易產生紅細胞增多、血黏度增高等嚴重不良反應，額外增加了心血管疾病危險因素，極大限制了EPO的臨床應用。Brines等[3]通過分析EPO空間構象，合成了一種11個氨基酸殘基組成的線性多肽鏈——促紅細胞生成素衍生肽（HBSP），在動物模型中顯示出良好的組織保護作用，且無促紅細胞生成的不良反應。本課題組前期研究結果亦證實，HBSP可顯著抑制大鼠心肌缺血/再灌注損傷，減少梗死面積[4]。但是HBSP對I/ RI的心肌微血管內皮細胞（CMECs）是否具有保護作用及其可能涉及的機制并未見報道。本研究通過建立模擬缺血/再灌注模型，觀察HBSP對于缺血/再灌注的CMECs是否有保護作用，并進一步探討其具體機制。

1 材料與方法

實驗動物和材料：2013-07至2014-08納入雄性SD大鼠10只，體重80～100 g，購于第四軍醫大學實驗動物中心。HBSP（純度≥98%）購自上?？齐纳锟萍加邢薰?。重組人EPO（rhEPO）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）特異性抑制劑LY294002購自美國Millipore公司。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）特異性抑制劑雷帕霉素購于美國Cell signaling公司。蛋白激酶B（AKT）抗體及磷酸化蛋白激酶B（pAKT）抗體、mTOR抗體及磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR）抗體、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）抗體及磷酸化核糖體S6蛋白激酶（pp70S6K）抗體來自美國Abcam公司。

CMECs分離培養及鑒定：采用酶消化法分離CMECs，具體步驟見參考文獻[5]。采用免疫細胞化學染色進行細胞鑒定，具體步驟見參考文獻[6]。

模型的建立及分組：模擬缺血/再灌注（SI/R）模型的建立見參考文獻[7]。更換培養液為缺血液（含NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2·2H2O、HEPES、脫氧葡萄糖、連二硫酸鈉、乳酸；pH=6.5），37℃缺氧孵箱內孵育2 h后，更換正常培養液或含藥物的培養液，37℃5% CO2孵箱內孵育4 h后進行各項檢測。CMECs隨機分組:①對照組：正常培養液培養，不加任何干預；②模擬缺血/再灌注組（SI/R組）；③模擬缺血/再灌注+重組人促紅細胞生成素組（SI/ R+rhEPO組）：再灌注時更換加入含rhEPO 10 IU/ ml的培養液；④模擬缺血/再灌注+促紅細胞生成素衍生肽組（SI/R+HBSP組）：再灌注時更換加入含不同濃度的HBSP（2.5、25、50、100 ng/ml）的培養液。確定HBSP的最適濃度后，用此濃度進行細胞遷移能力及凋亡率的測定。研究保護機制的實驗分組：①對照組；②SI/R組；③SI/R+HBSP組：HBSP最適濃度為25 ng/ml；④SI/R+HBSP+磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）抑制劑（LY294002）組：再灌注液除含HBSP外，還含有30 μmol/L的LY294002；⑤SI/ R+HBSP+雷帕霉素組：再灌注液除含HBSP外，還含有10 nmol/L的雷帕霉素。

噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖能力：參照文獻[8]，取同一批的CMECs，將細胞密度調整至5×104/ml接種于96孔板，每組接種100 μl，每組設5個復孔。待細胞生長至80%匯合后，按上述方法進行分組及造模。復氧結束后加入MTT 20 μl，繼續孵育4 h,終止培養。小心吸棄孔內的上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min待結晶物充分溶解后，用酶標儀于波長490 nm處測定各孔吸光度（A） 值。

末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端

標記測定（TUNEL）法檢測CMECs的凋亡率：制備細胞爬片，按上述方法分組及造模后，按照試劑盒說明書進行操作。冷丙酮室溫固定20 min后，0.1%Triton X-100孵育2 min（冰上），磷酸鹽緩沖液（PBS，成分為NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）沖洗。加入TUNEL混合溶液，37℃避光孵育1 h。續用4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）室溫孵育10 min，PBS沖洗。抗熒光淬滅劑封片后，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。TUNEL染色陽性為凋亡細胞，呈綠色熒光，DAPI對所有細胞核進行染色，呈藍色熒光。每張爬片隨機選取5個視野進行計數，統計細胞總數和凋亡細胞數，取其平均值。凋亡率（AI）=凋亡陽性細胞數/總細胞數×100%。

細胞劃痕法測定CMECs的遷移能力：參照文獻[8]，取同一批CMECs，將細胞密度調整至1×106/ml接種于6孔板，每孔接種2 ml，待細胞后生長匯合后，吸棄孔內培養液，用200 μl移液器槍頭垂直于培養板底部均勻劃痕。將孔板置于倒置顯微鏡下拍照，每孔任選3個視野拍照記錄劃痕區的相對距離。而后按上述方法進行隨機分組，模型建立后繼續以含1%FBS的DMEM培養液繼續培養24 h后取出拍照，記錄各組劃痕后的相對距離，測定CMECs的遷移能力。

免疫蛋白印跡法（Western Blot）檢測AKT等相關蛋白的表達：預冷PBS沖洗收集細胞，細胞裂解液裂解，低溫離心后取上清，參照文獻[9]，按照二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒說明書測定蛋白濃度。而后采用濕轉的方法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）后，置于含5%脫脂乳的TBST封閉緩沖液（含有 Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=7.4）中封閉，加入pAKT、pmTOR、pp70S6K一抗4℃孵育過夜。加二抗37℃孵育1 h，經化學發光法曝光后觀察結果。隨后Stripping 緩沖液解離一抗，漂洗并重新封閉印跡膜，檢測三種信號分子AKT、mTOR、p70S6K的表達。采用Bio-image（Bio-Rad）分析軟件采集信號和灰度掃描。

統計學方法：用SPSS 14.0軟件進行統計學分析，數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，再以LSD-t檢驗分析相應兩組差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CMECs的鑒定：CMECs吞噬Alexa594紅色熒光標記的乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）后，細胞質呈紅色熒光，DAPI染色后細胞核呈藍色熒光。圖1

圖1 心肌微血管內皮細胞鑒定（×400）

CMECs增殖能力的檢測：與對照組（0.411±0.020）相比，SI/R組（0.180±0.010）吸光度值明顯下降（ P＜0.01）。再灌注時與SI/R組比，SI/R＋rhEPO組以rhEPO作用于CMECs后，吸光度值顯著增高為0.245±0.015（P＜0.05），SI/R+HBSP組以不同濃度的HBSP（2.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml）作用于CMECs后，吸光度值均增高，分別為0.241±0.011、0.320±0.010、0.282±0.014、0.263±0.017（P＜0.05）；不同濃度的HBSP相比，中濃度HBSP（25 ng/ml）時，CMECs增殖能力最強（圖2）。此濃度為最適濃度，后續研究保護機制的實驗用此濃度進行。

圖2 噻唑藍（MTT）比色法檢測心肌微血管內皮細胞增殖能力

HBSP對SI/R誘導的凋亡的影響：與對照組（3.54%±0.21%） 相比，SI/R組（41.1%±0.8）的CMECs的凋亡率顯著增加（P＜0.001）；與SI/R組（41.1%±0.8%）相比，rhEPO組（25.5%±0.43%）凋亡率降低（P＜0.01）；與SI/R組和SI/R+rhEPO組

相比，HBSP（25 ng/ml）組凋亡率顯著下降，為16.9%±0.78%（P＜0.01）。

CMECs遷移能力比較：細胞劃痕實驗顯示，與對照組相比，再灌注24 h后SI/R組圖3E中劃痕后的相對距離較寬（細胞遷移能力明顯減弱）；而與SI/R組相比，SI/R+HBSP組圖3F中劃痕后的相對距離縮窄（細胞遷移能力增強）。圖3

圖3 細胞劃痕實驗檢測心肌微血管內皮細胞遷移能力圖（×100）

AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平改變：Western blot 檢測顯示，與SI/R組相比，SI/R+HBSP組AKT的磷酸化水平顯著增加（P＜0.05），這一效應可被PI3K抑制劑LY294002（30 μmol/L）部分抵消（P＜0.05），而雷帕霉素（10 nmol/L）的使用則對AKT的磷酸化水平無明顯影響（圖4A）。

因上游調控AKT的方式之一是依賴PI3K，當使用LY294002后可阻止此信號通路，下調AKT的磷酸化表達；而mTOR位于AKT下游，故雷帕霉素的使用對AKT的活化無影響。與SI/R組相比，SI/R+HBSP組mTOR的磷酸化水平亦有顯著性提高，這一效應可被LY294002及雷帕霉素部分抵消（P＜0.05，圖4B）。

同樣，與SI/R組相比，HBSP組mTOR下游分子p70S6K的磷酸化水平也顯著性增高，而使用LY294002及雷帕霉素處理后，這一效應被部分消除（P＜0.05，圖4C）。

圖4 免疫印跡法檢測心肌微血管內皮細胞內AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化水平

3 討論

I/RI機制復雜。近年來研究發現，I/RI在微血管水平的病理變化主要表現為 CMECs 正常屏障功能損傷和細胞凋亡[5]。并且，研究證實在再灌注早期，CMECs的凋亡要早于心肌細胞， 并可通過釋放一些炎性介質，促發心肌細胞凋亡，提示減少再灌注后CMECs 的凋亡將對抑制心肌I/RI具有重要作用[10]。

促紅細胞生成素（EPO）是由腎臟合成并分泌的一種激素。以往研究發現EPO在減少I/RI心肌細胞凋亡、縮小梗死面積、改善梗死后心功能和心肌重構等方面有重要保護作用[11]。然而，研究數據顯示，EPO發揮組織保護作用的最低濃度要遠高于其發揮促紅細胞生成作用的最低濃度，在組織損傷初期，需要極高濃度的EPO才能發揮組織保護作用，從而大量紅細胞生成導致的不良反應成為難以調和的矛盾[12]。鑒于此，Brines等[3]通過分析EPO空

間構象，合成了一種由11個氨基酸殘基構成的線性多肽鏈（Helix B-surface peptide），并進一步證實HBSP可特異性結合EPO βc受體（CD131），促進神經系統損傷修復，即使重復給藥也不會增加紅細胞和血小板數量[13]。最新研究顯示HBSP可顯著減少大鼠心梗模型心肌梗死面積,減少TNF-α誘導的離體心肌細胞凋亡[14]。我們課題組前期研究亦證實，HBSP可抑制在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷[4]。

但是，HBSP對大鼠I/RI的離體CMECs是否具有保護作用還不明確。本研究結果顯示，I/RI可抑制CEMCs的增殖能力和遷移能力，并可誘導細胞凋亡，與以往文獻結果相似[15]。而再灌注時給予HBSP，可顯著增加CMECs的增殖能力，提高CMECs的遷移能力，抑制I/RI誘導的CMECs凋亡。近年來研究顯示，EPO和HBSP均可通過激活AKT通路顯著抑制腫瘤壞死因子-α誘導的離體心肌細胞凋亡[14]。我們的前期研究結果亦證實，HBSP可通過激活PI3K/AKT通路，抑制在體大鼠I/RI[4]。但其對I/RI的離體CMECs的保護作用及其具體機制尚未研究。我們的研究結果顯示，與SI/R組相比，HBSP可上調AKT、mTOR、p70S6K蛋白的磷酸化表達；而采用PI3K特異性抑制劑LY294002、mTOR特異性抑制劑雷帕霉素后，與HBSP組相比，AKT等相關蛋白的磷酸化水平顯著下降，提示HBSP對I/RI的CMECs的保護作用可能與PI3K/AKT/mTOR通路有關。

由于CMECs在心肌微循環中的特異性，其可作為預測血管功能的指標之一，如何保護I/RI過程中的CMECs，已成為心血管病防治的重要內容之一。心臟內EPO受體也在內皮細胞中表達，而HBSP作為EPO衍生物，可特異性結合EPO受體，故用HBSP治療能夠防止再灌注期內皮細胞凋亡，進而保護心肌，維持血流，且避免了EPO促血栓形成等副作用。由于凋亡活性在再灌注期達到頂峰，所以對于接受溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療術后的患者應用HBSP治療可能獲得明顯的益處。

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Investigation of Helix B-surface Peptide Protecting the Cardiac Micro-vascular Endothelial Cell Injury by Ischemia/reperfusion in Experimental Rats

WANG Chen, SI Rui, ZHANG Ming-ming, YU Wen-jun, HAO Qi-meng, ZHANG Rong-qing, WANG Hai-chang.
Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an (710032), Shan’xi, China

Objective: To investigate the effect of Helix B-surface peptide (HBSP) reducing the cardiac micro-vascular endothelial cells (CMECs) injury by ischemia/reperfusion (I/R) in experimental rats with possible mechanisms.

Helix B-surface peptide; Cardiac micro-vascular endothelial cells; Ischemia/reperfusion injury; Apoptosis

2014-10-18）

（編輯：許 菁）

國家自然科學基金（81200100）

710032 陜西省西安市，中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院 心內科

王琛 碩士研究生 主要從事心血管病學研究 Email: wangchen1398@sina.com 通訊作者：王海昌 Email: wanghc@fmmu.edu.cn

R54

A

1000-3614（2015）03-0280-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.020