曲美他嗪干預對心力衰竭大鼠心肌細胞線粒體超微結構、心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、細胞色素C蛋白表達的影響

馮翔宇，趙亮，馮佩明，李秀華

曲美他嗪干預對心力衰竭大鼠心肌細胞線粒體超微結構、心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白、細胞色素C蛋白表達的影響

馮翔宇，趙亮，馮佩明，李秀華

目的：探討曲美他嗪干預對心力衰竭（心衰）大鼠左心室心肌細胞線粒體超微結構、心肌細胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白和細胞色素C蛋白表達的影響。

方法：雄性wistar大鼠30只隨機分為假手術組、心衰模型組、曲美他嗪組，每組10只。除假手術組外，其余兩組大鼠采用腎上腹主動脈縮窄法建立慢性心衰模型，其中曲美他嗪組大鼠給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃4 w。觀察各組左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室壓力最大上升及下降速率（±dp/dtmax）；蘇木素伊紅（HE）染色法觀察大鼠心肌細胞形態結構；透射電鏡觀察心肌細胞線粒體超微結構；原位缺口末端標記（TUNEL）法檢測心肌細胞凋亡指數（AI）；SP免疫組織化學法檢測各組大鼠左心室心肌細胞caspase-3蛋白、細胞色素C蛋白的表達。

結果：與假手術組比較，心衰模型組大鼠心肌細胞線粒體形態發生明顯改變，排列紊亂，空泡變性，LVEDP顯著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明顯降低（P＜0.01），心肌細胞凋亡指數、caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與心衰模型組相比，曲美他嗪組大鼠心肌細胞線粒體形態變化明顯改善，LVEDP明顯下降（P＜0.01），±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），心肌細胞凋亡指數、caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

結論：曲美他嗪可有效改善心功能，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能與保護心肌細胞線粒體功能有關。

心力衰竭；細胞凋亡；線粒體； caspese-3蛋白；細胞色素C蛋白

Methods: A total of 30 male Wister rats were randomly divided into 3 groups: Sham group, the rats received operation without constriction, followed by intragastric administration of normal saline, n=10; the rest animals received suprarenal aortic constriction to establish HF model and further divided into 2 group: HF model group, the rats received intragastric administration of normal saline and Trimetazidine group, the rats received intragastric administration of timetazidine at 10 mg/(kg·d). n=10 in each group, all animal were treated for 4 weeks. Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and the maximum left ventricular pressure rising and falling (±dp/dtmax) were measured. The morphology of myocardium was observed by HE staining, myocardial ultra-structure was examined by transmission electronic microscopy, apoptotic index (AI) was detected by TUNEL assay. The expressions of caspase-3 and cytochrome C were evaluated by immunohistochemistry.

Results: Compared with Sham group, the rats in HF model group showed the morphological changes of myocardial mitochondria as disordered structure with vacuolar degeneration; increased LVEDP, P＜0.01 and decreased (±dp/dtmax),

P＜0.01; elevated AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01. Compared with HF model group, the rats in Trimetazidine group presented obviously improved myocardial mitochondrial morphology, much lower LVEDP, P＜0.01 and higher (±dp/dtmax), P＜0.01; reduced AI and the expressions of Caspase-3, Cytochrome C, P＜0.01.

Conclusion: Trimetazidine may effectively improve cardiac function and inhibit cadiomyocyte apoptosis, which might be related to the protection of mitochondrial function in experimental HF rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:276.)

心力衰竭（心衰）作為各種心臟病的終末階段，其發生發展中存在著心肌缺血及凋亡事件，這些都與心肌代謝密切相關[1,2]。曲美他嗪是一種改善心肌代謝的藥物，主要用于抗心絞痛的治療。目前研究表明，曲美他嗪在治療心衰中可有效干預心肌能量代謝，抑制心肌細胞凋亡[3]，但其具體作用機制，亟需進一步探討。本實驗通過縮窄大鼠腎上腹主動脈建立慢性心衰模型，探討曲美他嗪干預對心衰大鼠心肌細胞線粒體超微結構、心肌細胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白、細胞色素C蛋白表達的影響。

1 材料與方法

材料：本實驗于2013-01至2014-01選取清潔級雄性Wistar大鼠30只購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證編號：2009-0004）；鹽酸曲美他嗪（瑞陽制藥有限公司）；原位缺口粒端標記（TUNEL）法試劑盒（美國羅氏公司）；caspase-3兔抗多克隆抗體（武漢博士德公司）；細胞色素C蛋白兔抗多克隆抗體（美國Santa cruz公司），SP免疫組織化學試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

實驗動物分組、模型建立：清潔級雄性Wistar大鼠30只，200～230 g，適應性喂養1 w后，按隨機數字隨機分為假手術組、心衰模型組、曲美他嗪組，每組10只。利用腎上腹主動脈縮窄手術處理心衰模型組和曲美他嗪組大鼠復制慢性心衰模型[4,5]。制作步驟：將三組大鼠均用3%戊巴比妥鈉0.15 ml/100 g腹腔注射麻醉，剪毛后在腹部劍突下沿正中線切開皮膚2～3 cm，分層切開腹腔，分離出的腹主動脈，用“0”號絲線穿過左腎動脈上方，用絲線將腹主動脈和磨鈍的7號手術針一同結扎，注意松緊度，然后抽出手術針，確定腹主動脈通暢后分層關腹。假手術組大鼠只分離腹主動脈不予結扎。各組大鼠術后均給予20萬單位青霉素腹腔注射，連續給藥3天。

模型成功標準及處理方案：常規喂養4 w后，心衰模型組和曲美他嗪組大鼠逐漸出現精神萎靡、食欲減退、體重增長緩慢、脫毛等表現，測血流動力學參數時造模成功的標準為左心室舒張末期壓（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。造模成功后曲美他嗪組大鼠每天給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃，心衰模型組及假手術組給予等量生理鹽水灌胃，連續4 w[6,7]。

血流動力學監測：至各大鼠實驗8 w后將大鼠測體重后，按0.15 ml/100 g給予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經右頸總動脈逆行插管至左心室，接通壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統，監測大鼠LVEDP，左心室內壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）。

標本留取：每組隨機抽去2只取左心室前壁1 mm×1 mm×1 mm大小的組織2～3塊，先用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸后固定，用于透射電鏡觀察。取各組剩余8只大鼠部分左心室固定在4%多聚甲醛中留待石蠟包埋用于蘇木素伊紅（HE）染色、TUNEL法、免疫組織化學法檢測。

形態學觀察：HE染色觀察各組大鼠心肌細胞的大體結構；透射電鏡觀察心肌細胞線粒體超微結構變化。

TUNEL法檢測心肌凋亡指數（AI）：用TUNEL法，二氨基聯苯胺（DAB）顯色液顯色，細胞核染成棕褐色為陽性細胞。在高倍視野（×400）下每個標本隨機觀察6個視野，計算細胞總數和陽性細胞數各取平均值，按公式：凋亡指數（AI）=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%，計算心肌細胞凋亡指數。

免疫組織化學法檢測caspase-3蛋白和細胞色素C蛋白的表達情況:嚴格按免疫組化試劑盒步驟操作，抗體工作濃度均為1：50，陰性對照用PBS緩沖液代替一抗。caspase-3蛋白和細胞色素C蛋白陽性產物為分布于細胞質的棕黃色顆粒。用WiVnt圖像分析系統對結果進行半定量分析，每個標本隨機

觀察4個高倍鏡視野，用陽性產物面積/視野面積表示該抗原的相對含量，取其平均值。

統計學方法：采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVE），兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

血流動力學指標比較：與假手術組比較，心衰模型組和曲美他嗪組LVEDP顯著升高（P＜0.01），±dp/dtmax明顯降低（P＜0.01），差異有統計學意義；與心衰模型組比較，曲美他嗪組LVEDP明顯下降（P＜0.01），±dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），差異有統計學意義。表1

表1 各組大鼠血流動力學指標比較

表1 各組大鼠血流動力學指標比較

注：與假手術組比較*P＜0.01；與心力衰竭模型組比較△P＜0.01。LVEDP：左心室舒張末壓+dp/dtmax：左心室內壓最大上升速率 -dp/dtmax：左心室內壓最大下降速率。1 mmHg=0.133 kPa

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光學顯微鏡下HE染色各組大鼠心肌細胞形態改變：假手術組大鼠心肌細胞排列緊密、規則，形態正常，結構清晰，無炎細胞浸潤；心衰模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞部分肥大、水腫，結構模糊，可見炎細胞；曲美他嗪組大鼠心肌細胞介于其他兩組之間，心肌改變較模型組有所改善。圖1

圖1 光學顯微鏡下蘇木素伊紅染色各組大鼠心肌細胞的形態改變（×400）

透射電鏡下各組大鼠心肌細胞的超微結構改變：假手術組大鼠心肌細胞線粒體大小均勻，結構完整，線粒體嵴清晰完整，肌纖維排列整齊；心衰模型組大鼠心肌細胞線粒體大小不一，腫脹，可見空泡樣變，結構不完整，部分線粒體嵴溶解斷裂，肌纖維水腫，排列紊亂，甚者斷裂；曲美他嗪組大鼠心肌細胞線粒體腫脹不明顯，有變形，線粒體嵴排列稍紊亂，肌纖維排列較整齊，存在輕度溶解。圖2

圖2 透射電鏡下各組大鼠心肌細胞的超微結構改變（×3000）

TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡指數（apoptosis index，AI）：假手術組僅有少量凋亡細胞，心衰模型組和曲美他嗪組均較假手術組的凋亡細胞增多（P＜0.01），與心衰模型組比曲美他嗪組大鼠心肌凋亡細胞減少，差異均有統計學意義（P＜0.01）。表2、圖3

免疫組織化學法檢測各組大鼠心肌組織caspase-3蛋白和細胞色素C蛋白的表達：各組大鼠心肌細胞caspase-3蛋白與細胞色素C蛋白的陽性表達均為棕黃色顆粒，位于細胞質中。假手術組僅有少量caspase-3蛋白及細胞色素C表達。與假手術組比較，心衰模型組和曲美他嗪組大鼠心肌細胞的caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白表達明顯增多顏色明顯加深；與心衰模型組比較，曲美他嗪組大鼠心肌細胞的caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。表2、圖4、圖5

圖3 TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡（×400）

圖4 免疫組織化學二氨基聯苯胺染色法檢測各組大鼠心肌組織caspase-3蛋白的表達（×400）

圖5 免疫組織化學二氨基聯苯胺染色法檢測各組大鼠心肌組織細胞色素C蛋白的表達（×400）

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡指數、caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡指數、caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達

注：與假手術組比較*P＜0.01；與心力衰竭模型組比較△P＜0.01

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3 討論

心肌細胞凋亡是心肌細胞內預存的死亡程序被某些刺激因子啟動，在心衰的發生發展中起到重要作用，其中線粒體途徑是一個非常重要的通路系統[8]。細胞色素C蛋白是啟動線粒體介導的凋亡通路的關鍵因子，而caspase-3蛋白是各種凋亡路徑級聯反應中的關鍵因子，在線粒體途徑凋亡途徑中也具有重要作用[9]。研究表明，在一些凋亡刺激信號作用下，線粒體轉運孔的孔徑增大，使得線粒體的外膜被破壞，使本來存在于線粒體的細胞色素C蛋白釋放到胞質當中[10]。細胞色素C蛋白可以與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、caspase-9前體、dATP結合成凋亡復合體，使caspase-9活化，然后激活caspase-3蛋白，抑制DNA修復酶活性，激活細胞核的內切酶，切割DNA最終導致細胞凋亡[11]。

心衰時心肌細胞處于能量代謝重構狀態，心肌能量代謝功能障礙最終加速心肌細胞凋亡導致心室重塑[2,12]。曲美他嗪作為影響心肌代謝類藥物，可促使心肌細胞的代謝由游離脂肪酸β-氧化，向葡萄糖的有氧氧化轉換，進而優化心肌能量代謝；與此同時，曲美他嗪可抑制氧自由基的產生、抑制Na+及Ca2+的超載、減輕細胞內酸中毒，保護細胞線粒體膜的穩定性[13,14]。

本實驗研究，用曲美他嗪干預的心衰大鼠，觀察各組大鼠的心功能、血液流變情況、線粒體超微結構、細胞凋亡指數及大鼠心肌細胞caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達，來探討曲美他嗪在心衰治療中的作用機制。實驗表明曲美他嗪可改善心衰大鼠的心功能，改善心肌細胞線粒體的病變，降低心肌細胞凋亡指數，下調心衰大鼠心肌細胞caspase-3蛋白及細胞色素C蛋白的表達。

綜上所述，曲美他嗪具有改善心功能，抑制細胞凋亡，延緩心衰的作用，其機制可能與改善心肌細胞線粒體形態結構，減少細胞色素C蛋白的表達，降低caspase-3蛋白的表達，減少細胞色素C釋放，抑制caspase-3蛋白活性有關，其詳細機制有待進一步探討。

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Effect of Trimetazidine on Myocardial Ultra-structure, Cardiomyocyte Apoptosis and Expressions of Caspase-3, Cytochrome C in Experimental Rats With Heart Failure

FENG Xiang-yu, ZHAO Liang, FENG Pei-ming, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China

Objective: To investigate the effect of trimetazidine on myocardial ultra-structure, cardiomyocyte apoptosis, and expressions of caspase-3, cytochrome C in experimental rats with heart failure (HF).

Heart failure; Apoptosis; Mitochondrial; Caspase-3; Cytochrome C

2014-04-24）

（編輯：梅 平）

067000 河北省承德市，承德醫學院附屬醫院 老年病科（馮翔宇、李秀華），神經內科（趙亮），超聲科（馮佩明）

馮翔宇 碩士研究生 主要從事慢性心力衰竭的臨床及病理生理研究 Email：fengxiangyu_1@126.com 通訊作者：李秀華

Email：Lixiuhua76@126.com

R541

A

1000-3614（2015）03-0276-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.019