Caspase-3/Caspase-9活化與皮鱗癌1號方抑制A431細胞生長的關系研究

許 俏，羅 俊，潘年松，劉英波，丁 斗，張學愈，張 玨

(1.上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院，上海 202150;2.貴陽醫學院，貴州貴陽 550004;3.遵義醫藥高等專科學校，貴州遵義 563000)

據報道，90%的皮膚癌與紫外線照射損傷有關。近年來，由于臭氧層的破壞及人們的室外活動增加，皮膚癌特別是鱗狀細胞癌的發病率明顯上升;但目前臨床治療皮膚癌的方法有限，尋找一種新的有效的防治皮膚癌的天然藥物就成為當前亟待解決的課題之一。

1 材料

1.1 藥物 皮鱗癌1號方(SSP)由白頭翁、莪術等中藥組成(工藝、質量標準見專利申請號:2013104223796.7)，試驗品由遵義醫藥高等專科學校提供，每毫升相當于生藥2 g，以白頭翁皂苷B4含量及浸膏收率作為質量控制標準，低溫保存備用。

1.2 試劑 高糖的Dulbecco modified eagle medium(DMEM)、胎牛血清購自 Hyclone公司，3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)購自Amresco公司。

1.3 細胞系 A431細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

2 方法

2.1 細胞培養 A431細胞培養于含10%胎牛血清、青霉素(100 U·L-1)和鏈霉素(100 U·L-1)的高糖DMEM培養基中，置于5%CO2、37℃飽和濕度的培養箱中。

2.2 MTT法測皮鱗癌1號方對A431細胞的增殖抑制作用 取對數生長期的細胞，調整細胞密度為每毫升1.25×105，每孔160 μL 接種于96 孔板。培養24 h后，每孔加40 μL不同濃度的藥物，藥物濃度設5個梯度，分別為原藥的1/400、1/200、1/100、1/50、1/25，因每毫升皮鱗癌1號方相當于2 g生藥，經換算后得到藥物劑量相當于5(A2組)、10(A3組)、20(A4組)、40(A5 組)、80(A6組)mg·L-1，每個組設5個復孔，每組加40 μL。同時設空白對照組(A0組，加200 μL無血清培養基)、陰性對照組(A1組，不加藥物)、陽性對照組(A7組，5-Fu 10 mg·L-1)。分別培養 24、48、72 h 后，棄去上清，加 200 μL 無血清培養基及 20 μL MTT(5 g·L-1)，置于二氧化碳培養箱培養4 h后，棄上清，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后，于酶聯免疫檢測儀490 nm處測定吸光度值(OD值)。細胞存活率(%)=(實驗組OD-空白對照組OD)/(陰性對照組OD-空白對照組OD)×100%。

2.3 Hochest33258染色法觀察細胞凋亡 藥物干預48 h后，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，每次5 min。加入500 μL染色液，混勻，室溫放置30 min。棄去染色液，用PBS清洗3遍后，置于熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態變化，激發波長為346 nm，發射波長為460 nm。

2.4 ELISA測定細胞色素C(Cytc)含量 藥物干預48 h后，收集細胞，用裂解儀裂解。低溫離心20 min，3 000 r·min-1，取上清。細胞色素C檢測試劑盒(安迪生物科技有限公司)說明操作。

2.5 比色法測定 Caspase-3、Caspase-9活性 藥物干預48 h后，吸取細胞培養液備用。用胰酶消化細胞，并收集至備用的細胞培養中。600 g 4℃離心5 min收集細胞后，小心清除上清。PBS洗滌一次，吸盡上清后，按每200萬細胞加入100 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4℃ 20 000 g離心15 min，把上清轉移到預冷的離心管中。按Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)說明操作。

2.6 統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行統計分析。觀測資料主要為定量數據，均通過正態性檢驗，文中以(±s)描述之。多組多時點觀測資料則采用兩因素重復測量方差分析。所有檢驗均為雙側檢驗，并以α=0.05作為檢驗水準。

3 結果

3.1 形態學觀察 顯微鏡下觀察可見:陰性對照組細胞貼壁生長，生長狀態良好，呈多邊形或不規則形，折光性強。皮鱗癌1號方處理后，A431細胞增殖變緩，細胞出現皺縮，與周圍細胞黏附力減弱。隨著該藥物濃度增加，上述現象更加明顯。可見細胞大片脫落，細胞數明顯減少，胞質內黑色顆粒增多，可見死亡細胞。見圖1。

3.2 皮鱗癌1號方對A431細胞的存活影響(增殖抑制作用) 本實驗采用MTT法檢測皮鱗癌1號方在不同劑量濃度和不同作用時間條件下對A431細胞的增殖抑制效應(數據以存活率方式體現)，見表1。對該表資料分別做兩因素重復測量方差分析:6個劑量組間(空白對照A0組為實驗備份觀查組，未列入MTT法測試及其它觀測項目，故表1及其它各表中均無該組資料)，3個時點間，整體上差異均有統計學意義(P＜0.05)，且劑量和時間的交互作用也有顯著性意義(P＜0.05)。遂進行精細比較并結合數據來看:皮鱗癌1號方在不同濃度、不同作用時間對A431細胞增生存活率的影響(反映抑制作用)，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且隨著藥物作用濃度增加和時間的延長，皮鱗癌1號方對A431細胞的增殖抑制率也逐漸增強，表現為存活率下降(P＜0.05)。說明皮鱗癌1號方對A431細胞增殖具有顯著的抑制作用，且呈時間—劑量依賴性。

表1 對A431細胞的存活率影響分析(±s，n=5)

表1 對A431細胞的存活率影響分析(±s，n=5)

注:(1)此表資料為兩因素重復測量資料，數據經正態性檢驗通過;經球型性檢驗后，以H-F法進行涉時間自由度調整;(2)整體分析方法為兩因素重復測量方差分析;整體分析的顯著性水準α=0.05;(3)精細比較為t檢驗(組間為成組檢驗，時點間為差值檢驗);精細比較的顯著性水準調整為α’=0.01。

A1組:陰性對照組A2組:5 mg·L-1 A3組:10 mg·L-1 A4組:20 mg·L-1 A5組:40 mg·L-1 A6組:80 mg·L-1 A7組:5-Fu T1:24 h 87.91 ±1.58 82.13 ±6.11 71.05 ±5.40 56.48 ±5.98 38.17 ±7.80 20.06 ±4.09 83.25 ±5.90 T2:48 h 96.46 ±1.83 73.69 ±3.42 62.22 ±4.34 47.20 ±9.76 26.34 ±3.48 8.46 ±1.97 74.57 ±5.44 T3:72 h 99.40 ±0.71 56.28 ±8.00 41.36 ±1.84 33.60 ±6.54 15.36 ±3.56 4.41 ±1.05 50.31 ±3.36整體分析F，P (HF系數:0.6875)組間比較 272.812，0.000時點間比較 188.773，0.000組 × 時點 23.738，0.000組間比較t，P A1 vs A2 A1 vs A3 A1 vs A4 A1 vs A5 A1 vs A6—T1 2.128，0.066 6.741，0.000 11.40，0.000 13.94，0.000 34.81，0.000 —T2 13.203，0.000 16.470，0.000 11.16，0.000 40.21，0.000 73.58，0.000 —T3 11.923，0.000 66.005，0.000 22.20，0.000 51.40，0.000 167.87，0.000 —時點比較t，P A1 A2 A3 A4 A5 A6—T2 vs T1 11.073，0.000 3.760，0.020 3.085，0.037 1.948，0.123 4.028，0.016 8.508，0.001 —T3 vs T1 17.191，0.000 5.892，0.004 15.007，0.000 6.024，0.004 8.522，0.001 10.720，0.000—

3.3 Hochest33258染色觀察細胞凋亡形態 藥物作用48 h后，用Hochest33258染色。在熒光倒置顯微鏡下觀察，陰性對照組細胞均勻呈現微弱熒光，熒光完整，細胞核較大，染色質分布均勻;用藥組細胞出現細胞凋亡形態學特征，細胞核呈較強藍色熒光，提示胞核固縮，大小不一，染色質凝聚。見圖2。

3.4 細胞色素C含量測定 結果提示，藥物作用A431細胞48 h后，細胞色素C表達隨著藥物作用劑量的增加而增加，與陰性對照組比較，差別非常明顯，見表2。

3.5 比色法檢測 Caspase-3、Caspase-9活力 結果提示，皮鱗癌1號方高、中、低劑量組與陰性對照組比較，Caspase-3、Caspase-9活力增加，且隨著藥物作用濃度增高，Caspase-3、Caspase-9活力增強，差別非常明顯，見表3。

表2 ELISA法測皮鱗癌1號方作用A431細胞48 h后細胞色素C表達(±s，n=3)

表2 ELISA法測皮鱗癌1號方作用A431細胞48 h后細胞色素C表達(±s，n=3)

組別 劑量/mg·L-1 細胞色素C/nmol·L -1陰性對照組 —12.36 ±2.58 SSP低劑量組 5 49.62±26.41 SSP 中劑量組 10 58.76±5.28 SSP 高劑量組 20 135.18±26.19 5-Fu組10 27.04 ±5.80

表3 比色法測Caspase-3、Caspase-9活性(±s，n=3)

表3 比色法測Caspase-3、Caspase-9活性(±s，n=3)

組別 劑量/mg·L-1 Caspase-3/mmol·L-1 Caspase-9/mmol·L -1陰性對照組 —17.13 ±0.80 7.30 ±0.67 SSP 低劑量組 5 19.47 ±1.72 9.18 ±1.22 SSP 中劑量組 10 22.10 ±1.05 12.90 ±1.08 SSP 高劑量組 20 20.67 ±0.72 10.66 ±0.88 5-Fu組10 17.47 ±0.86 8.61 ±0.50

4 討論

腫瘤是一種細胞周期性疾病，與細胞的無限增殖及增殖周期失控有關。手術、化療和放療是腫瘤治療的三大主要手段。然而，各種治療方法在一定程度上都有其局限性，而中藥具有毒性低、不良反應小等優勢。大量的臨床實踐研究表明，中藥的多層次、多靶點、多環節的作用機制特點［1-2］，在提高惡性腫瘤的臨床療效，逆轉腫瘤的多藥耐藥性以及改善病人生活質量方面，發揮著越來越重要的作用［3］。

白頭翁又名白頭草，為毛茛科多年生草本植物。現代藥理學研究發現白頭翁具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫功能的作用［4］。莪術的主要有效部位為根，揮發油是其主要活性成分。莪術油具有抗癌、抗氧化等作用［5］。

細胞凋亡是指在凋亡基因調控下細胞自主有序死亡的一種方式。細胞凋亡時發生的最顯著的變化就是染色體固縮，DNA裂解使細胞核形態發生變化。Hochest33258熒光染料是一種無毒、水溶性的可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，在聚AT序列富集區域的小溝處與DNA結合。在凋亡細胞中，細胞膜對33258的攝取量增多，并且由于染色體高度濃縮，Hochest33258與之結合增強，染色呈強藍色熒光，而正常細胞只呈微弱熒光，死細胞則不被染色，由此可檢測出凋亡。細胞凋亡的機制非常復雜，機體內的細胞凋亡信號轉導途徑主要有線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路［6］，而線粒體通路是最常見的凋亡信號通路。Cytc是線粒體呼吸鏈中的一個基本成分，正常情況下，Cytc位于線粒體膜間隙，呈電穩定性結合于線粒體內膜，不能通過線粒體外膜。當在外界NO等因子的刺激下，線粒體發生聚集，Cytc便釋放到胞漿中［7］。Cytc從線粒體釋放到細胞漿是多種細胞凋亡的共同表現［8］，是線粒體介導的細胞凋亡途徑中不可或缺的重要因子，在凋亡過程中起著重要作用［9］。在細胞凋亡的發生機制中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的激活是細胞凋亡過程中的關鍵元件，目前已知的幾條凋亡信號傳導通路均要依賴Caspase家族的級聯反應［10］。它的激活與超常表達均引起細胞凋亡，因此又稱死亡蛋白酶。Caspase分為三大類:凋亡啟動因子、凋亡執行因子和炎癥介導因子，組成了級聯放大效應。位于級聯反應上游區域的細胞凋亡起始因子包括 Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9等，可識別和活化下游區域細胞凋亡執行因子Caspase-3等，誘導凋亡的發生［11］。Cytc從線粒體釋放后，在dATP和或(ATP)的作用下，與胞漿中的凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)形成多聚復合物，通過Apaf-1氨基末端的Caspase募集域募集胞質中的Caspase-9前體，Caspase-9剪切活化，進一步激活效應Caspase-7和Caspase-3，從而啟動Caspase級聯反應［12］。Caspase-3作為Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，在凋亡過程中扮演著重要的效應分子的角色［13］，Caspase-3的激活標志著細胞凋亡進入了不可逆轉的階段［14］。

綜上所述，筆者認為，皮鱗癌1號方能抑制A431細胞的生長，與其能促進Cytc的釋放，活化Caspase-3和 Caspase-9，誘導 A431細胞發生凋亡有關。

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