哺乳動物胚胎體外培養的研究進展

丁 芳(綜述)，周紅林(審校)

(1.三峽大學仁和醫院婦產科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫學院第二附屬醫院婦科，昆明 650101)

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哺乳動物胚胎體外培養的研究進展

丁 芳1※(綜述)，周紅林2(審校)

(1.三峽大學仁和醫院婦產科，湖北 宜昌 443001； 2.昆明醫學院第二附屬醫院婦科，昆明 650101)

葡萄糖對卵裂階段胚胎的發育有抑制作用，但早期胚胎體外發育中添加葡萄糖并不是完全不必要的，8-細胞前需要非必需氨基酸，8-細胞及以后利用所有氨基酸。低濃度必需氨基酸促進胚胎發育，高濃度必需氨基酸抑制胚胎發育。牛血清白蛋白等大分子物質既能供給胚胎營養，促進細胞生長、增殖與分裂，又能消除血清的不利影響，是很好的蛋白質替代品，一些生長因子對胚胎發育起積極作用。共培養及序貫培養雖可以改善胚胎發育狀況，但也存在一些負面影響。

哺乳動物；胚胎；體外培養

哺乳動物早期胚胎的體外培養已經歷了半個多世紀的發展，大量的實驗室研究主要集中在培養液優化上，對于培養液的優化主要體現在兩個方面：一種是改進化學成分明確的培養液，如在化學成分明確的培養液中適當減除、替代或添加某些組分來改進培養液，因此需要掌握簡單培養液中的基本成分有哪些及各自的作用是什么，這樣才有利于對處理因素的觀察分析，有利于探討早期胚胎的發育機制；另一種采用體細胞與胚胎共同培養，或將胚胎在不同發育階段放入不同培養液中進行序貫培養等，其目的在于提高哺乳胚胎的體外發育率、種植率及妊娠率。該文旨在研究哺乳動物胚胎最佳體外培養條件，以期體外培養胚胎更接近體內自然狀態，從而進一步推動生命科學相關學科的發展。

1 培養液及其發展

自1956年Whitten[1]成功實現小鼠胚胎體外的培養以來，培養基經歷了無數次的更新與發展，如早期的簡單培養液、Brinster′s培養液、修正的Whitten′s培養液、M16、MTF和HTF培養液等，這些培養液雖然在一些品系的小鼠上取得成功，但遇到一個共同的難題，即“2-細胞阻滯”現象。Chatot等[2-3]發明了CZB培養液，同時用該培養液培養小鼠胚胎，使部分品系的小鼠突破了2-細胞阻滯現象，發育到囊胚。隨后，Lawitts和Biggers[4]設計了KSOM培養液，增加更多品系小鼠胚胎的囊胚發育率。復合培養液同樣經歷了無數次的改進，最早的復合培養液有20世紀50年代設計的Ham′sF10、TCM199，隨后80年Keefer等[5]發現了BME和Ham′sF10(1∶1)的混合培養液，證實該培養液更利于兔胚胎的體外發育。后來，Jin等[6]發現了RDH(RPMI1640/DMEM/Ham′s F10 1∶1∶1)和RD(RPMI1640/DMEM 1∶1)的混合培養液，同時體外培養囊胚成功并獲得仔兔。每一次發現都在不同程度上改善了哺乳動物胚胎的體外發育率，都是生命科學史上里程碑的一次突破。

2 培養液主要成分

2.1 能量底物 哺乳動物輸卵管液和子宮液中的主要能量底物有丙酮酸、乳酸及葡萄糖，不同物種的生殖道中，這3種能量底物的濃度各不相同。研究證實，哺乳動物早期胚胎卵裂階段的主要供能物質是丙酮酸和乳酸，葡萄糖對卵裂階段胚胎的發育有抑制作用，致密化期以后主要利用葡萄糖供能。然而，近年來研究表明，葡萄糖對綿羊、豬的植入前胚胎的體外發育無抑制作用[7]。有研究發現，一種含有恒定濃度4.7 mmol/L 葡萄糖的復雜培養液，能完全支持人類受精卵發育到囊胚階段[8]。生理狀態下哺乳動物輸卵管和子宮液中能檢測到葡葡糖的存在，由此可以推測，早期胚胎體外培養液中葡萄糖的添加并不是完全不必要的，葡萄糖在早期胚胎體外發育中具體的作用時間及作用機制目前尚不完全清楚。

2.2 氨基酸 自1990年國外研究者首次發現了氨基酸在小鼠胚胎體外培養中的作用以來，人們對氨基酸進行了反復的研究，Eagle將氨基酸分為必需氨基酸和非必需氨基酸，在2-細胞階段添加非必需氨基酸和谷氨酸能提高小鼠囊胚形成率、細胞數、孵化率和移植后發育潛力[9-10]。非必需氨基酸還能促進8～16細胞到囊胚階段哺乳動物胚胎發育[11]，8-細胞前添加必需氨基酸抑制囊胚的發育[4]，8-細胞階段添加必需氨基酸卻能促進內細胞團的發育和隨后胎兒的發育[12]，低濃度的必需氨基酸對水牛體外受精-胚胎移植的胚胎的發育具有一定促進作用,但高濃度則有抑制作用[13]。必需氨基酸的濃度降到半濃度時，能提高小鼠植入前胚胎的體外發育[14]。有研究發現，高濃度的必需氨基酸代謝和自由降解中會產生對胚胎有毒性的銨。當以1 mmol/L的谷氨酰胺衍生物丙氨?；?谷氨酰胺替代谷氨酰胺時，可以顯著降低銨的生成[14]。同時添加必需和非必需氨基酸到MSOM培養液中，濃度為Eagle′s培養液一半時，能支持小鼠受精卵發育到囊胚后期，而且能促進內細胞團的增殖[15]。

2.3 蛋白質和大分子物質 有研究發現，血清能提高早期胚胎體外發育的囊胚率[16]，培養系統中血清成分的缺乏會影響胚胎表面微絨毛的發育。胎牛血清可以促進豬孤雌胚胎的早期體外發育[17]。添加混合血清能促進水牛胚胎體外發育[18]。牛血清白蛋白對山羊體外受精卵具有明顯促卵裂作用[19]。胰島素樣生長因子2、胰島素能增加體外培養的囊胚細胞數[20]，表皮生長因子及胰島素樣生長因子2對體外培養鼠胚的發育有協同促進作用[21]。0.1 μg/L胰島素樣生長因子2和表皮生長因子作為胚胎培養濃度較佳[22]。白細胞抑制因子促進2～8細胞胚胎發育至桑椹胚，同時也能促進桑椹胚向擴大囊胚和孵化囊胚發育，白細胞介素1β、白細胞介素2、白細胞介素6及干擾素γ對綿羊早期胚胎的發育無顯著影響[23]。

3 培養體系的改進

3.1 共培養 國外有研究證實不合適的培養體系可以導致胚胎發育異常，20世紀80年代末期，研究者們研究出一種新型的培養技術——細胞共培養技術，細胞共培養是將2種或2種以上的細胞共同培養于同一環境中，共培養能使細胞間相互溝通信息，相互支撐生長增殖，能更真實地模擬體內環境。國內研究者認為共培養體系主要有以下優點：誘導細胞向另一種細胞分化、誘導細胞自身的分化、維持細胞的功能和活力、對細胞增殖進行調控、促進早期胚胎的發育和提高代謝物的產量。有學者采用人卵丘細胞、昆明鼠卵丘細胞、昆明鼠成纖維細胞分別與昆明鼠2細胞期胚胎共培養，發現不同類型的體細胞共培養體系均可在體外為胚胎發育提供一種更類似于體內的環境，有利于胚胎在體外發育[24]。含有小鼠輸卵管上皮細胞+垂體細胞的CZB培養液可有效促進小鼠孤雌胚胎突破2細胞阻滯[25]。在體外環境下,牛體外胚胎與子宮內膜細胞共培養后能正常孵化[26]。共培養能顯著提高2-細胞發育率、降低胚胎內部H2O2水平，提高4-細胞率及降低胚胎內部H2O2水平[27]。

3.2 序貫培養與序貫共培養 與胚胎培養全程在同一培養液中進行遠不能滿足胚胎對營養物質的需求，鑒于這一理論，人們提出了序貫培養，常用的序貫培養液有用于人胚胎培養G1/G2。劉軍等[28]研究證實，與傳統的培養液相比，序貫培養液G1/G2能更好地支持山羊核移植胚胎的發育。G1/G2支持綿羊、牛和豬的體外受精胚胎發育的報道也屢見不鮮。國內有研究發現，SOF培養液和顆粒細胞+添加胎牛血清的NCSU-23 輸卵管上皮細胞的序貫培養系統能較好地促進胚胎的發育。后來，有學者又將序貫培養和共培養聯合起來對胚胎進行體外培養，發現序貫聯合子宮內膜細胞共培養的方法與單純的體外序貫培養相比，其囊胚形成率更高，是進行廢胚繼續體外培養的更有效方法[29]。冷凍胚胎經序貫共培養能改善胚胎發育潛能，子宮內膜細胞共培養聯合序貫成組培養對人早期冷凍時限較長的胚胎發育具有積極的支持作用[30-31]。

4 小 結

哺乳動物著床前胚胎培養是一個不斷發展的領域，目前的培養基及培養體系尚需進一步完善，以期體外培養環境與體內環境最接近，但由于脫離母體環境，胚胎的發育率及質量仍有很多問題。如體外發育過程中暫時結構正常，隨后可能出現基因分化、染色體變異等，這可能是細胞凋亡、胚胎流產、死亡的重要原因，因此，培養基及培養體系的改進是一個值得長期深入研究的課題。

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Research Progress in Mammalian Embryos Cultured in Vitro

DINGFang1，ZHOUHong-lin2.

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,RenheHospitalofThreeGorgesUniversity,Yichang443001，China; 2.DepartmentofGynecology,the2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650101,China)

Glucose has inhibitory effect on embryos development in cleavage stage,but it is unnecessary to add glucose in early embryos development in vitro,embryos before stage of 8-cells need non-essential amino acid,embryos of and after stage of 8-cells need all amino acids.Low concentration of essential amino acids can promote the embryonic development,while high concentration of essential amino acids inhibit embryonic development.Bovine serum albumin and other macromolecules can supply nutrition to the embryos,as well as promote cell growth,proliferation,differentiation,and eliminate the adverse effects of serum,which makes them very good protein substitutes.Many growth factors also have positive effects on embryonic development.Coculture and sequential culture can improve the status of embryonic development,although there are also some negative effects.

Mammals; Embryo; Culture in vitro

S814.8

A

1006-2084(2015)12-2166-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.020

2013-08-30

2014-11-03 編輯：伊姍