H7N9禽流感病毒基因檢測技術研究進展

張 賽(綜述)，陸 軍(審校)

(1.安徽理工大學醫學院病原學與免疫學教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預防控制中心檢驗科，安徽 滁州 239000)

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檢測醫學

H7N9禽流感病毒基因檢測技術研究進展

張 賽1,2△(綜述)，陸 軍1※(審校)

(1.安徽理工大學醫學院病原學與免疫學教研室，安徽 淮南 232001； 2.滁州市疾病預防控制中心檢驗科，安徽 滁州 239000)

2013年3月在上海和安徽兩省市率先發現人感染H7N9禽流感病例，現已累計報告數百例病例。H7N9禽流感病毒因其對人類的高致病性和迅速的傳播速度引起全球的廣泛關注?？焖?、準確的檢測對H7N9禽流感的疫情監測和控制極為重要。該文就目前應用于H7N9禽流感病毒研究中的基因檢測技術(包括聚合酶鏈反應、環介導等溫擴增、基因芯片、液相芯片、依賴核酸序列擴增法、高通量測序等)的研究進展予以綜述。

禽流感病毒;H7N9；基因檢測技術

2013年3月底，上海和安徽兩地率先發現人感染H7N9禽流感病例，引發此次疫情的是一種新型重配病毒[1-3]。人感染H7N9禽流感病毒臨床表現為發熱、咳嗽和少痰等流感樣癥狀[4]。目前，尚不能排除人傳人的可能[5]。H7N9禽流感病毒檢測是人感染H7N9禽流感防治的關鍵環節之一，其病原學檢測實驗室要求高，條件苛刻，不易普遍實施?；驒z測技術具有敏感性高、特異性強、簡潔、快速等優點，克服了病原學檢測的局限性，為H7N9禽流感病毒檢測提供了新途徑。因此，基因檢測技術在H7N9禽流感病毒防治中將會有更重要的應用前景?，F主要對國內外檢測H7N9禽流感病毒的基因檢測技術進行綜述。

1 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)是利用體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復性)及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，在短時間內獲得大量目的基因。PCR是近年來學者研究的熱點之一，現已廣泛應用于H7N9禽流感病毒檢測，具有快捷、敏感、特異等優點。

1.1 實時反轉錄-PCR(reverse transcriptase PCR,RT-PCR) 近年來，以基因檢測技術為基礎的禽流感病毒檢測方法飛速發展，實時RT-PCR是RNA病毒基因檢測中使用最普遍的分子擴增法，通過擴增標本中病毒基因組RNA片段，可鑒定流感病毒并進一步亞型分析[6]，被認為是H7N9禽流感檢測的金標準[5,7]。Gao等[1]利用RT-PCR在3例患者的咽拭子中提取到H7N9禽流感病毒核酸。該方法使用廣泛，但反轉錄的DNA分子易污染實驗儀器和環境，試驗結果會出現假陽性和假陰性。

1.2 實時熒光定量RT-PCR 實時熒光定量RT-PCR技術在1996年由美國Applied Biosystems公司推出[8]，是在RT-PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號變化實時檢測PCR擴增反應中循環擴增產物量的變化，通過循環閾值和標準曲線對起始模板進行定量分析的方法。Wong等[9]設計的“一步法”實時熒光定量RT-PCR 對H7N9禽流感病毒檢測，靈敏度達到0.04 TCID50(半數組織培養感染性量)，整個檢測過程只需要3 h。Zhu等[10]針對1例安徽株和2例上海株H7N9禽流感病毒的HA、NA基因序列設計特異性引物和賽博綠熒光標記探針，通過測試106拷貝/μL～10拷貝/μL系列10倍稀釋的體外轉錄病毒，以循環閾值對應的RNA拷貝數構造標準曲線，建立以賽博綠為探針的RT-PCR檢測方法；結果顯示，該試驗建立的H7、N9標準曲線循環閾值與對應的RNA拷貝數具有很好的線性關系，H7相關系數為0.991，N9相關系數為0.997，最低檢測限為10拷貝，與Taqman探針靈敏度類似。實時熒光定量RT-PCR具有敏感性高、特異性強、快速并且可以對樣品進行定量分析的優點，已大規模使用于流感監測網絡實驗室。

1.3 多重RT-PCR 多重RT-PCR法是在同一PCR反應體系中加入2個以上病毒亞型或多種病毒的特異性引物，利用目的片段的長度不同，可實現多個病毒亞型或多種病毒在一個反應中同時檢測，是一種快速、敏感且經濟有效的檢測方法。羅思思等[11]針對H7N9禽流感病毒的HA、NA基因保守序列設計特異性引物和探針建立雙重RT-PCR；結果顯示，該方法具有快速、特異和敏感的優點，檢測下限為102 拷貝/L；實現了對H7N9禽流感病毒檢測的“一步法”，引物的特異性和探針的特異性保證了結果的準確性，同時比普通PCR檢測技術靈敏度高100倍以上。莫秋華等[12]針對H7N9禽流感病毒的HA和NA基因設計特異性引物，選擇人源基因beta-actin設計質控引物，通過優化實驗條件建立“一步法”四重RT-PCR 反應體系，對混合樣進行提取，沒有非特異擴增產物出現，反應體系特異性強，對不同亞型病毒的檢測無交叉反應，引物之間無相互干擾，對30份核酸樣品經盲法試驗評價與實時熒光RT-PCR檢測結果完全一致，符合率為100%。

2 環介導等溫擴增

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術是Notomi等[13]在2000年建立的一種新型核酸恒溫擴增技術，通過對靶基因的6個不同區域設計2對外引物和2對內引物，在恒溫(60～65 ℃)條件下，通過鏈置換嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillus stearothermophilus，Bst)DNA聚合酶的作用反應l h，實現目的靶序列從很低拷貝數擴增到109拷貝數。董志珍等[14]利用LAMP檢測H7N9禽流感病毒(安徽株)，其靈敏度達到10拷貝，靈敏度與實時熒光定量RT-PCR一致，該方法具有操作簡單、快捷、特異性強、靈敏度高等特點，反應結果根據擴增副產物形成的沉淀肉眼直接判斷。因其不依賴專門的儀器設備可在基層或小型實驗室進行現場檢測、臨床快速診斷，是一種新型的H7N9禽流感病毒快速檢測的技術與方法。Ge等[15]利用RT-LAMP對80份H7N9禽流感臨床樣本的HA基因和NA基因進行擴增檢測，其靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均為100%。Zhang等[16]利用RT-LAMP對135例臨床樣本檢測，試驗可在12～23 min完成；H7亞型基因的檢出限度為10拷貝,而其對應的N9基因檢測限度為5拷貝,靈敏度是實時熒光定量RT-PCR的100倍。

3 基因芯片

基因芯片的基本原理是將RT-PCR獲得的病毒基因的互補DNA(complementary DNA，cDNA)或合成的特異性寡核苷酸探針固化于芯片上，然后用不同熒光標記序列或樣品(DNA或cDNA)與芯片上Cy3、Cy5標記的核酸探針標記的靶核苷酸序列進行雜交，通過對雜交信號的檢測進而獲取細胞或組織的大量基因信息[17]。王慧煜等[18]對29份H7亞型陽性標本進行正向雜交基因芯片檢測,結果與病毒分離的結果符合率達100%。王秀榮等[19]依據M蛋白進行基因型鑒定和HA基因亞型鑒定，用Cy5熒光標記在基因芯片平臺上構建檢測H7亞型禽流感病毒的實驗技術模型，檢測H7亞型的cDNA,雜交達到預期結果。基因芯片技術具有特異性好、檢測時間短等優點，但因其檢測成本高、硬件要求高等缺點，在流感病毒檢測中的應用還遠低于其他檢測方法。

4 液相芯片

液相芯片，也稱為懸浮陣列、流式熒光技術，是基于美國Luminex公司研制的多功能流式點陣儀開發的多功能生物芯片平臺[20]。它是通過紅、綠兩束激光分別檢測可進行100種不同生物學反應的微球探針上的編碼和報告熒光來實現定性和定量的目的，是繼基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子檢測技術平臺，是將數字信號處理技術、流式細胞技術、激光技術及傳化學技術融為一體的新型生物分子檢測技術。張曉娜等[21]針對H7亞型禽流感保守基因，設計特異性引物和探針，將多重不對稱RT-PCR擴增產物與偶聯熒光微球的探針進行雜交,建立多重液相芯片檢測方法，對50份已知病毒的樣品進行液相芯片方法和禽流感檢測試劑盒雙盲試驗，兩者符合率為100%，H7亞型禽流感核酸的最低檢出量為28.7 pg/μL，檢測的特異性良好，且禽流感常見病毒與其他亞型無交叉反應，重復性試驗的變異系數在10%以內。

5 依賴核酸序列的擴增法

依賴核酸序列的擴增法(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一項以RNA為模板無需反轉錄的快速等溫擴增技術，賴于鳥類成髓細胞瘤病毒反轉錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設計的特異性寡核苷酸引物和分子信標探針共同協作而完成。Collins等[22]基于M基因和H7亞型的HA基因已成功開發出可檢測禽流感群特異性H7亞型(NASBA-H7)的NASBA/ECL(電化學發光)檢測試劑盒，檢出時間只需6 h，比商品化的免疫檢測試劑盒敏感至少高1000倍，比常規PCR方法也敏感許多，與現行病毒培養的檢測方法靈敏度相當,可準確無誤地檢測出病毒。該方法的優點是RNA分子不易對實驗儀器和環境造成污染，避免了試驗結果的假陽性，缺點是檢測成本過高。

6 高通量測序

高通量測序又名下一代測序，是將目標DNA剪切為小片段結合到固相表面進行獨立擴增，每次只復制1個堿基(A、C、T、G)，通過高分辨率的成像系統檢測信號。趙康辰等[23]以U12引物反轉錄cDNA,通用流感病毒全基因擴增引物混合物生成雙鏈cDNA制備高通量測序模板對8份樣品進行檢測，從模板制備、文庫構建到序列及數據分析等在2 d內完成；該方法不需要進行PCR擴增，病毒RNA可直接制備測序模板，測序模板用量只需要1 ng的雙鏈cDNA，具有準確性高、周期短、可同時對多個樣本進行檢測且成本相對較低等優點，使大規模H7N9禽流感病毒基因組檢測變為現實。

7 小 結

H7N9禽流感疫情爆發讓公眾的眼光再次聚焦于流感實驗室診斷?；驒z測技術為H7N9禽流感提供了高靈敏度、強特異性且快速的診斷，為疫情的控制提供了寶貴的時間和準確的流行病學信息，避免了疫情的大規模蔓延。但基因檢測技術并不能解決所有問題，有一定的局限性。因此，在H7N9禽流感病毒的檢測過程中，要不斷探索不同檢測技術及不同學科之間的融合，取長補短，推進H7N9禽流感病毒基因檢測技術進入新的發展階段。

[1] Gao R,Cao B,Hu Y，etal.Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J].N Engl J Med，2013,368(20):1888-1897.

[2] Feng Y,Mao H,Xu C,etal.Origin and characteristics of internal genes affect infectivity of the novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J].PLoS One，2013,8(11):e81136.

[3] Wu S，Wu F，He J．Emerging risk of H7N9 influenza in China[J]．Lallcet，2013，381(9877)：1539-1540．

[4] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案[S].2014-01-24.

[5] Li Q,Zhou L,Zhou M,etal.Epidemiology of human infections with avian influenza A(H7N9) virus in China[J].N Engl J Med，2014,370(6):520-532.

[6] Wang R,Taubenberger JK.Methods for molecular surveillance of influenza[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8(5):517-527.

[7] Corman VM,Eickmann M,Landt O,etal.Specific detection by real-time reverse-transcription PCR assays of a novel avian influenza A(H7N9)strain associated with human spillover infections in China[J].Euro Surveill，2013,18(16):20461.

[8] 李安,謝金文.熒光定量PCR技術在分子檢測上的研究進展[J].中國畜牧獸醫,2009, 36(4)：73-76.

[9] Wong CK,Zhu H,Li OT,etal.Molecular detection of human H7N9 influenza A virus causing outbreaks in China[J].Clin Chem，2013,59(7):1062-1067.

[10] Zhu Z,Fan H,Qi X,etal.Development and evaluation of a SYBR green-based real time RT-PCR assay for detection of the emerging avian influenza A (H7N9) virus[J].PLoS One，2013,8(11):e80028.

[11] 羅思思,謝芝勛,劉加波，等.H7N9亞型AIV雙重實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫學進展,2013,34(12):1-5.

[12] 莫秋華,羅寶正,杜田，等.四重RT-PCR快速檢測2013新型H7N9禽流感病毒[J].中國國境衛生檢疫雜志,2013,36(5):296-299.

[13] Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000,28(12):

E63.

[14] 董志珍,鄭文杰,王乃福，等.H7N9禽流感病毒等溫擴增快速檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2013,30(7):72-77.

[15] Ge Y,Wu B,Qi X,etal.Rapid and sensitive detection of novel avian-origin influenza A (H7N9) virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral-flow device[J].PLoS One，2013,8(8):e69941.

[16] Zhang J,Feng Y,Hu D,etal.Rapid and sensitive detection of H7N9 avian influenza virus by use of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification[J].J Clin Microbiol，2013,51(11):3760-3764.

[17] Livingston AD，Campbell CJ，Wagner EK，etal.Biochip sensors for rapid and sensitive detectionof viral disease[J].Genome Biol，2005，6(6):112.

[18] 王慧煜,韓雪清,林祥梅,等.檢測禽流感病毒H5、H7和H9亞型的正向基因芯片的制備[J].檢驗檢疫學刊,2009,19(4):2-16．

[19] 王秀榮,鄧國華,于康震，等.在DNA芯片平臺上探測AIV不同亞型 cDNA[J].中國農業科學,2005,38(2):394-398.

[20] 陳瑋.液相芯片技術的原理與應用進展[J].成都醫學院學報,2008,3(3)：225-231.

[21] 張曉娜,王慧煜,梅琳，等.H5、H7和H9亞型禽流感病毒液相芯片檢測方法的建立[J].中國獸醫科學,2013,43(5):494-499.

[22] Collins RA,Ko LS,Fung KY,etal.Rapid and sensitive detection of avian influenza virus subtype H7 using NASBA[J].Biochem Biophys Res Commun，2003,300(2):507-515.

[23] 趙康辰,郭喜玲,祁賢，等.高通量測序H7N9禽流感病毒基因組模板制備方法的優化及應用[J].南京醫科大學學報：自然科學版,2013,33(7)：1002-1006.

Advance in Gene Techniques for Detection of Avian Influenza A (H7N9) Virus

ZHANGSai1,2,LUJUN1.

(1.DepartmentofAetiology&Immunology,MedicalCollege,AnhuiUniversityofScience&Technology，Huainan232001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,ChuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuzhou239000,China)

In March 2013,cases of avian influenza A(H7N9) infection have been firstly found in Shanghai and Anhui,and there has been hundreds of cases reported so far.The influenza A(H7N9) is a pathogen with highly pathogenicity to human and able to spread rapidly,which has attracted global attention.It is very important to establish a rapid and sensitive method for avian influenza A(H7N9) detection and control.Here is to make a review of the gene techniques used in detection of avian influenza A,including polymerase chain reaction,loop-mediated isothermal amplification,gene chip,liquid chip,nucleic acid sequence-based amplification and high-throughput sequencing.

Bird flu virus; H7N9; Gene detection techniques

R373.13；R511.7

A

1006-2084(2015)12-2226-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.042

2014-10-10

2014-12-18 編輯：鄭雪