干細(xì)胞治療卵巢早衰的進(jìn)展

劉 雪，佳那提·秋瓦西，李朝曦，劉沐蕓，胡 祥(綜述)，蘇放明※(審校)

(1.深圳市北科生物科技有限公司，廣東 深圳 518057； 2.深圳市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518020)

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干細(xì)胞治療卵巢早衰的進(jìn)展

劉 雪1，佳那提·秋瓦西1，李朝曦2，劉沐蕓1，胡 祥1(綜述)，蘇放明2※(審校)

(1.深圳市北科生物科技有限公司，廣東 深圳 518057； 2.深圳市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518020)

卵巢早衰已成為當(dāng)今婦女不孕癥的主要病因之一，且近年來發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、增加社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。其病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚不十分清楚。目前主要采用激素替代治療等方法來控制疾病進(jìn)展，暫無根治方法。干細(xì)胞移植是近年來的研究熱點(diǎn)之一，成為治療卵巢早衰的新方法。該文通過回顧干細(xì)胞治療不同病因?qū)е侣殉苍缢サ呐R床前研究資料，對可能的治療機(jī)制予以綜述，希望為后續(xù)研究提供參考。

卵巢早衰；干細(xì)胞；修復(fù)

卵巢早衰是指女性在40周歲以前，除妊娠外，由某種原因?qū)е碌拈]經(jīng)，以血清雌激素水平下降、促性腺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平升高為特征的疾病。目前被廣為接受的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)為：女性40周歲以前出現(xiàn)至少4個月的閉經(jīng)，卵泡期血清檢測2次或以上(2次檢查間隔不少于1個月)均提示血清FSH水平>40 U/L，常伴有雌二醇<73.2 pmol/L[1]。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計提示，女性40歲以前的發(fā)病率為1%，30歲以前的發(fā)病率為1‰；原發(fā)性閉經(jīng)中卵巢早衰占10%～28%，繼發(fā)性閉經(jīng)中卵巢早衰占4%～18%，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2]，目前尚無特效的治療手段。近年來間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療成為臨床研究的熱點(diǎn)，為卵巢早衰的臨床治療提供了新的希望，并取得了初步的療效。現(xiàn)就干細(xì)胞治療卵巢早衰的研究進(jìn)展予以綜述。

1 卵巢早衰的病因及主要治療方法

卵巢早衰病因?qū)W較為復(fù)雜，目前尚未完全清楚，已知的病因主要包括：遺傳學(xué)因素(如脆性X染色體等)、免疫因素、感染因素、醫(yī)源性因素(如：化療、放療、免疫抑制劑的使用及手術(shù)治療等)、FSH及受體缺陷等。近來的研究表明，細(xì)胞免疫在一部分卵巢早衰的發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用；研究發(fā)現(xiàn)，卵巢早衰患者表現(xiàn)出不同程度的卵巢炎，例如卵巢中T淋巴細(xì)胞大量浸潤，同時伴有自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤[3]。目前卵巢早衰的治療措施主要包括心理治療、中醫(yī)治療和西醫(yī)治療，其中西醫(yī)治療中常用雌孕激素替代療法、促排卵治療、免疫治療及卵巢移植，這些治療方法雖然對卵巢早衰的臨床癥狀具有一定的緩解作用，但尚無法從根本上修復(fù)受損的卵巢功能。激素替代治療可以人為地通過激素類藥物提高患者血清激素水平，但仍無法恢復(fù)其生育功能，甚至可能還存在增加乳腺癌等惡性腫瘤的患病風(fēng)險。現(xiàn)在通過干細(xì)胞移植生成有功能的卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞，有望從根本上解決這一難題。

2 干細(xì)胞治療的可行性

干細(xì)胞是一類早期未分化細(xì)胞，具有自我更新、自我復(fù)制、無限增殖及多向分化潛能等特點(diǎn)，從來源角度可分為成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞[4]。胚胎干細(xì)胞研究存在來源較少、倫理爭議大、存在致瘤性及免疫排斥風(fēng)險等問題，使其臨床應(yīng)用受到較大限制。成體干細(xì)胞廣泛存在于人體全身組織，易分離培養(yǎng)、擴(kuò)增，免疫原性低，具有強(qiáng)大的遷移、免疫調(diào)節(jié)能力，對于修復(fù)組織缺陷及組織工程中作為種子細(xì)胞等方面都具有獨(dú)特的優(yōu)勢[4]。因此，MSCs已在細(xì)胞治療、基因治療及組織工程等領(lǐng)域被廣泛地研究與應(yīng)用。目前研究較多的MSCs包括：骨髓來源MSCs、外周血來源MSCs、臍帶來源MSCs、胎盤來源MSCs及羊水來源MSCs等[4]。臍帶 MSCs具有與骨髓MSCs類似的生物學(xué)特征，然而其在增殖能力、分化能力等方面優(yōu)于骨髓來源MSCs，同時兩者在細(xì)胞因子的分泌上亦有所不同。臍帶的來源較為廣泛，并且相對骨髓而言取材明顯便利，屬于醫(yī)療廢棄物，對供者無不良影響，同時異體移植無免疫排斥或排斥較弱，因此在臨床應(yīng)用上具有廣闊的前景。近年來，干細(xì)胞治療在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域獲得了很大的進(jìn)步，部分研究成果已開始在腫瘤疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等多種臨床試驗中得到應(yīng)用，在臨床研究方面也獲得了許多臨床數(shù)據(jù)，發(fā)表了許多干細(xì)胞臨床研究與應(yīng)用的相關(guān)報道[5]。目前臍帶MSCs已被用于針對系統(tǒng)性紅斑狼瘡、帕金森綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎損傷、失代償期肝硬化、肝衰竭等領(lǐng)域的研究治療，并且還可以作為基因治療的載體細(xì)胞[6-9]。MSCs還可用于治療多種組織損傷性疾病，如脊髓損傷、急性心肌梗死等[10-11]。臨床研究與應(yīng)用中常用的細(xì)胞移植途徑主要包括靜脈輸注、腹腔注射和局部注射等。

3 干細(xì)胞治療卵巢早衰臨床前資料

3.1 對免疫損傷型卵巢的修復(fù)作用 自身免疫異常是核型正常的卵巢早衰患者的重要病因之一。統(tǒng)計表明，大約20%的卵巢早衰是由于免疫系統(tǒng)不能識別自身卵巢組織所致，部分卵巢早衰患者血液中存在抗卵巢抗體，此類患者多伴有自身免疫性疾病，這類自身免疫性疾病常發(fā)生在卵巢早衰之前[12]。有研究人員利用豬卵巢蛋白主動免疫建立免疫損傷的小鼠卵巢模型，給模型及對照小鼠分別腹腔移植綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓MSCs及等量的磷酸鹽緩沖液，通過聚合酶鏈反應(yīng)檢測卵巢中綠色熒光蛋白基因，以判斷MSCs是否到達(dá)卵巢；通過蘇木精-伊紅染色法、細(xì)胞凋亡等方法分析MSCs對損傷卵巢的修復(fù)作用，發(fā)現(xiàn)腹腔移植的MSCs可以順利到達(dá)免疫損傷的卵巢組織；從卵巢結(jié)構(gòu)上分析，MSCs移植后，作為研究靶向器官的免疫損傷卵巢部位逐漸觀察到各級卵母細(xì)胞的增加；MSCs移植4周后，治療組小鼠的卵巢各部分細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)已恢復(fù)到與正常小鼠卵巢組織相似的水平，而對照組則與治療前改變不明顯，提示MSCs移植能顯著促進(jìn)免疫損傷小鼠卵巢結(jié)構(gòu)的修復(fù)；MSCs移植可能通過大量分泌細(xì)胞因子等機(jī)制，顯著減少免疫損傷卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[3]。

3.2 對化學(xué)損傷型卵巢的修復(fù)作用 MSCs不但對免疫損傷型卵巢早衰具有一定的修復(fù)作用，對化學(xué)損傷的卵巢早衰也具有一定程度的修復(fù)作用。有研究者用10%的雙氧水損傷卵巢建立卵巢早衰小鼠模型，對模型小鼠和對照小鼠分別腹腔移植MSCs及輸注等量的磷酸鹽緩沖液，通過觀察外觀和病理切片的方法研究MSCs是否對化學(xué)損傷卵巢有修復(fù)作用，發(fā)現(xiàn)移植MSCs組較對照組卵巢功能恢復(fù)更快，同時各級生長的卵泡數(shù)量也明顯多于對照組[13]。有研究者還使用局部注射方法將MSCs懸液注入去氧乙烯基環(huán)己烯所致的卵巢早衰模型小鼠雙側(cè)卵巢，觀察MSCs分布及探討卵巢早衰治療的可行性；該研究觀察了小鼠動情周期的變化、FSH與促黃體生成素的比值水平及移植后MSCs的分布等；結(jié)果顯示，注入卵巢的MSCs主要分布在卵巢間質(zhì)區(qū)，少量分布在卵巢泡膜細(xì)胞區(qū)；MSCs組動情周期較對照組縮短，F(xiàn)SH/促黃體生成素水平較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；即MSCs可以改善小鼠卵巢內(nèi)分泌功能，并長時間存在于卵巢組織，一方面可能是MSCs分泌的細(xì)胞因子抑制了卵巢細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)分泌類固醇激素細(xì)胞，另一方面可能是部分MSCs分化為卵巢細(xì)胞，替代受損細(xì)胞并促進(jìn)組織修復(fù)[14]。綜上所述，MSCs不僅對人為建立的卵巢早衰有修復(fù)作用，還能修復(fù)環(huán)境毒素對卵巢的損傷。

3.3 對放化療損傷型卵巢的修復(fù)作用 導(dǎo)致卵巢早衰的物理化學(xué)因素主要包括化療藥物和放療中的放射性照射等。卵巢接受化療毒性藥物及放射性照射后將直接破壞卵巢細(xì)胞及組織，可導(dǎo)致暫時或永久性閉經(jīng)；損傷的病理表現(xiàn)主要包括原始卵泡和發(fā)育卵泡消失、管硬化、間質(zhì)纖維化、玻璃樣變以及門細(xì)胞儲留等[15]。化療是目前治療腫瘤及某些自身免疫性疾病的主要手段之一，腫瘤年輕化和自身免疫性疾病好發(fā)于青年女性，使化療所致的卵巢早衰成為臨床關(guān)注熱點(diǎn)。Rahhal和Eugster[12]報道了1例因治療白血病患卵巢早衰在骨髓移植后8年卵巢功能恢復(fù)的病例。而Lee等[16]通過建立環(huán)磷酰胺所致的卵巢早衰小鼠模型，進(jìn)一步證實(shí)了骨髓移植能治療環(huán)磷酰胺所致不孕的雌性動物模型小鼠。付霞菲等[17]采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建立化療所致的大鼠卵巢早衰模型，建模成功后分實(shí)驗組和對照組，采用局部給藥方式給實(shí)驗組雙側(cè)卵巢輸注MSCs懸液，觀察大鼠卵巢恢復(fù)情況發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗組大鼠在激素水平、動情周期、卵巢切片方面均有明顯恢復(fù)，提示MSCs可一定程度修復(fù)環(huán)磷酰胺損傷的卵巢組織，甚至改善卵巢的內(nèi)分泌功能。其前期研究也顯示，MSCs能抑制環(huán)磷酰胺氮芥誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，MSCs可能通過這一途徑保護(hù)受損卵巢組織[18]。朱少芳[19]對MSCs治療化療損傷的卵巢早衰作了進(jìn)一步研究，比較了胎盤和臍帶來源的MSCs的治療作用；研究分別采用卵巢注射移植和尾靜脈注射移植的不同方式，探索最合適的細(xì)胞來源和最合適的移植方式；實(shí)驗結(jié)果提示，臍帶MSCs較胎盤來源MSCs更適于臨床應(yīng)用；對于給藥途徑，卵巢注射組大鼠FSH恢復(fù)較快，生育較早，但實(shí)驗后期達(dá)到均衡；考慮到靜脈注射損傷部位小，可多次注射或提高體內(nèi)臍帶MSCs的濃度，也許可以獲得更好的療效，因此有望成為卵巢早衰治療的新方式；實(shí)驗還觀察了實(shí)驗大鼠生育的幼鼠生長發(fā)育情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過細(xì)胞治療的大鼠所產(chǎn)幼崽與正常組比無明顯差異，提示臍帶MSCs移植可能并不影響子代的生長發(fā)育狀況。另外，多項研究已證實(shí)，體外條件下骨髓干細(xì)胞可以分化為性激素生成細(xì)胞，對雌小鼠進(jìn)行骨髓移植和外周血干細(xì)胞移植可使被化療藥物白消安、環(huán)磷酰胺消除的卵母細(xì)胞受體卵巢中重新出現(xiàn)卵母細(xì)胞和卵泡[17-19]。骨髓干細(xì)胞移植可恢復(fù)失去生殖能力的性腺功能，表明其可能分化為性激素生成細(xì)胞。

4 可能的修復(fù)機(jī)制

MSCs有“歸巢”屬性，即通過原位、靜脈或腹腔等途徑移植后，可遷移定植于特定的損傷部位如卵巢，并能在卵巢內(nèi)存活生長。上述動物實(shí)驗研究表明，移植MSCs后造模動物的卵巢形態(tài)、大小及動情周期都得到一定程度的恢復(fù)，病理組織切片上可以觀察到卵巢各級卵泡數(shù)明顯增加，顆粒細(xì)胞生長，抗顆粒細(xì)胞凋亡，內(nèi)分泌功能得到改善，甚至恢復(fù)受孕等。MSCs對于損傷組織的修復(fù)主要通過以下幾種途徑：①M(fèi)SCs自身可分泌多種細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、類胰島素一號增長因子等)，抑制細(xì)胞凋亡，修復(fù)受損組織細(xì)胞[20]；②MSCs定植于受損傷部位并進(jìn)行分化，部分補(bǔ)償或替代修復(fù)其功能；③通過免疫調(diào)節(jié)作用，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)受損組織的自身修復(fù)；④MSCs可通過修復(fù)卵巢間質(zhì)，防止卵巢纖維化，從而對受損卵巢起到保護(hù)作用；⑤MSCs進(jìn)入損傷卵巢后可能直達(dá)損傷部位，并分化成部分血管內(nèi)皮細(xì)胞，提供營養(yǎng)支持；⑥MSCs可能改變了一部分基因的表達(dá)，并通過基因的改變達(dá)到調(diào)控卵巢功能的作用[21]。

5 小 結(jié)

目前，臨床MSCs治療主要應(yīng)用在①局部種植：Strauer等[22]報道了對1例急性心肌梗死患者進(jìn)行MSCs移植治療的研究，該研究首次證明選擇性冠狀動脈移植MSCs是可行的，并能在梗死心肌區(qū)使心肌再生；②系統(tǒng)移植：MSCs在血液疾病的治療由來已久；③基因治療：MSCs是基因治療合適的靶細(xì)胞；④組織工程： MSCs為臨床治療提供了新思路，已經(jīng)在心臟和神經(jīng)修復(fù)等方面取得了可喜的成果。相信隨著研究的逐步深入，將為卵巢早衰的治療開拓新的途徑。

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Research Advance in Stem Cell Therapy for Premature Ovarian Failure

LIUXue1,JIANATIQiu-waxi1,LIZhao-xi2,LIUMu-yun1,HUXiang1,SUFang-ming2.

(1.ShenzhenBeikeBiotechnologyCo,Ltd,Shenzhen518057,China； 2.DepartmentofGynecologyandObstetrics,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen518020,China)

Premature ovarian failure(POF) has become one of main causes for female sterility,and the morbidity is increasing year by year recently.It seriously affects the quality of life for patients and increases the economic burden of society.The causes and pathogenesis of POF is complicated,and still remains unclear.At present,hormone replacement therapy is the main method to control the development of the disease while there is still no ideal cure treatment for it.Stem cell therapy has been one of the research hotspots during recent years,and might have become a new method for POF treatment.Here is to make a review of the possible mechanisms of the treatment for POF by retrospectively analyze the pre-clinical data of stem cell therapy for POF caused by different reasons,in order to provide reference for further studies.

Premature ovarian failure; Stem cell; Repair

R711.75

A

1006-2084(2015)12-2151-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.014

2014-08-05

2014-11-25 編輯：鄭雪