骨髓間充質干細胞成骨細胞分化研究進展

王 帥(綜述)，張霄雁,李哲海(審校)

(內蒙古醫科大學第三附屬醫院骨科，內蒙古 包頭 014010)

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骨髓間充質干細胞成骨細胞分化研究進展

王 帥△(綜述)，張霄雁※,李哲海(審校)

(內蒙古醫科大學第三附屬醫院骨科，內蒙古 包頭 014010)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)的基礎研究和臨床應用廣泛，BMSCs具有良好的成骨分化潛能，同時具有多向分化的能力，可向脂肪、骨、軟骨細胞分化。BMSCs在合適的生長因子作用下可以快速地向成骨細胞分化和增殖，并且具有容易取材、容易分離、容易擴增、多譜系轉化而不發生明顯免疫排斥反應等優點，在骨組織工程領域擁有廣泛的應用價值。但是，隨著使用增多，存在的問題也日益突出，如生物學特性、分離鑒定、誘導分化和臨床應用進展等問題還有待進一步解決。

骨髓間充質干細胞；成骨分化；組織工程

骨缺損和骨損傷是臨床常見病，常需植骨治療。對于這些損傷或疾病引起的骨缺損常依賴于異體和自體骨移植修復。自體骨移植主要缺點是供應有限，而同種異體骨主要缺點在于有致病性以及免疫原性，所以作為骨損傷修復材料不夠理想。20世紀80年代組織工程的出現實現了根據骨缺損具體情況任意塑形進而達到完善形態修復的要求，為實現真正意義上的無損傷修復創傷開辟了新途徑[1-2]。近年來，骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)因具備多方向分化的潛能而進行深入研究[1]。為了明確BMSCs的多向分化潛能，許多試驗研究采用加入一系列誘導劑的方法，順利地將BMSCs誘導分化為成骨細胞、神經細胞、成脂細胞等獲得了較大進展[1,3-6]。它的優勢逐步得到了認可，臨床廣泛用于骨損傷修復中[7]。現對骨髓間充質干細胞成骨細胞分化研究進展進行綜述。

1 骨髓間充質干細胞的生物學特性

存在于骨髓腔中的提供造血干細胞結構和功能的結締組織骨髓基質是由細胞間基質和基質細胞組成。雖然BMSCs取材容易，但是在骨髓中含量很低，僅為骨髓單個核細胞的0.000 1%～0.01%，所以還必須經過體外分離純化、大量擴增才可以作為組織工程種子細胞[8]。基于目前對BMSCs的研究及認識，BMSCs主要有以下方面特征表現。①BMSCs的自我復制、增殖能力：BMSCs 在體外適宜條件培養下的自我復制、增殖與其他細胞相同，可以不斷地自我更新，需通過生長滯緩期、對數增長期和生長平臺期。②間充質干細胞的表面抗原標識：BMSCs的表面標識與造血干細胞的差別在于，BMSCs 沒有明確的表面抗原，目前已有數個抗體可用于鑒定BMSCs，通過對分離出的BMSCs進行表面抗原鑒定，可判定所得到的細胞均一性及純度，也可大致判斷其是否來源于不同于骨髓造血干細胞的同類細胞，即BMSCs。③BMSCs的多向分化：實驗證明，BMSCs具備多向分化的能力，不同的微環境可使BMSCs向不同的組織細胞分化[4]，可是經過誘導分化，細胞是否能在體內很好地歸巢到指定部位，是否能有效發揮其應有的生理功能還需更進一步研究[6,9]。

2 BMSCs的分離培養及鑒定和成骨誘導

隨著研究的不斷深入，BMSCs 的體外分離純化、培養擴增以及鑒定技術獲得很大進展，然而，目前對于BMSCs向成骨細胞的定向誘導分化還沒有形成統一的認識[10-11]。

2.1 分離BMSCs的方法 用于分離BMSCs的方法是在 Friedenstein方法上改進的。目前主要包括4種：貼壁篩選法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選培養法及流式細胞儀分選法。可選用不同的培養基分離BMSCs，比較常用的是Dulbcco′s modified eagle′s medurn(DMEM)培養基。培養所采用的細胞密度也有所不同，經培養的BMSCs可以反復傳代，并且傳代后細胞保留了多向分化能力而未發生自然分化，而且經傳代后，BMSCs可達到較高純度[7]。2.2 骨髓間充質干細胞的鑒定 關于BMSCs的鑒定是個難點問題，主要原因是BMSCs的特異性表面標志物存在爭議[6]。通常通過其特有的形態和可向其他基質細胞系分化的功能來識別。國際間充質及組織干細胞委員會在2006年就人來源BMSCs實驗研究的鑒定提出了三條最低標準[8]：①通過標準培養，BMSCs必須具有對塑料底物黏附特性；②經使用流式細胞儀檢測后，BMSCs群體陽性表達CD73、CD105、CD90，且陰性表達CD45、CD34、CD19、CD79a及人白細胞相關抗原[6,8,12]；③經體外誘導，MSCs必須能向脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞分化[1]。比較公認的鑒定標識是BMSCs不表達淋巴細胞的表面抗原，如CD11a、CD11b等，且陰性表達造血細胞表面抗原如CD14、CD34、CD38、CD45等，但是可表達一些黏附分子，如CD29、CD44、CD166等，同時也可表達少許基質細胞表面抗原及細胞因子受體[12]。當前主要依靠形態和功能特性鑒定BMSCs[9]。

2.3 BMSCs成骨誘導

2.3.1 BMSCs分化成骨的方法 迄今為止BMSCs向成骨細胞的誘導尚未形成統一標準[1]。骨組織工程要求其向單一方向分化，所以其定向誘導調控有著重要意義。在BMSCs向骨、軟骨誘導分化的過程中，作為信號物質的各種生物誘導因子參與精細調節[13]，已被確認的物理因素(超聲波、生物力等)能與生物因子共同增強BMSCs成骨分化作用。現階段誘導BMSCs分化成骨的方法主要包括以下6 種:通過細胞因子作用分化[11]、與骨細胞共同培養分化、借助化學藥物作用分化、使用中藥提取物作用分化、物理方法分化以及轉基因作用分化。作為當前骨組織工程種子細胞，BMSCs是理想的選擇，關于骨髓基質細胞誘導分化為成骨細胞的報道很多，其結果為認識誘導分化機制提供了重要指導價值。

2.3.2 BMSCs定向誘導分化為成骨細胞的影響因素 BMSCs 定向誘導分化為成骨細胞的影響因素很多，其中主要受生物、化學、物理等三大因素影響。生物因素包括各種生長因子，如轉化生長因子[11]、骨形態發生蛋白[11,14]、核心結合因子1等[8]；化學因素主要是常規化學誘導劑[1]；物理因素如脈沖電磁場等。當前BMSCs定向誘導分化為成骨細胞的主要方法是化學誘導液誘導法，包括試劑地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等[6,15]。目前的研究認為，糖皮質激素對BMSCs 向成骨細胞定向分化有促進，也有抑制作用，其主要依賴于使用劑量、作用時間、細胞種類及細胞所處階段等[10]。有的觀點[15]認為，低劑量的地塞米松可促使BMSCs向成骨細胞方向定向分化，早期主要以合成細胞基質為主，后期則以鈣化為主，其作用機制可能在于地塞米松通過調節BMSCs的基因表達，促進BMSCs向成骨細胞方向分化，通過對成骨樣細胞的調控影響胰島素樣生長因子合成，進而影響膠原蛋白的合成，刺激其堿性磷酸酶活性。也有學者[15]發現骨形成發生蛋白2通過不同媒介方式作用修飾成骨細胞的骨形成來增強維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松等對BMSCs的成骨分化誘導能力，有數據表明[10]低劑量地塞米松保留了干細胞的增殖能力、表型以及多向分化能力，進而保留BMSCs在反復擴增過程中的干細胞源性。高濃度地塞米松不但使BMSCs增殖受到抑制，并且可促使BMSCs向成脂細胞分化。

3 成骨細胞鑒定

目前，對成骨細胞鑒定主要依賴其形態學特性及生物學特征。成骨細胞形態學觀察主要靠倒置顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察及透射電鏡觀察。成骨細胞生物學特性主要包括以下內容。①堿性磷酸酶：成骨細胞有合成、分泌堿性磷酸酶的功能，它可直接反映成骨細胞的活性或功能狀況，成熟成骨細胞內,堿性磷酸酶染色陽性[2,6,16]。目前常用的染色方法包括Gomori鈣鈷法、偶氮偶聯法及堿性磷酸酶染色試劑盒法。②膠原蛋白：經免疫組織化學Ⅰ型膠原蛋白染色后，成骨細胞顯棕色；經染色后的Ⅲ型膠原蛋白，成骨細胞偶而呈現淡棕色，這表明成骨細胞以合成Ⅰ型膠原為主[16-17]。③基質前體染色：成骨細胞合成的骨基質成分，經組織化學糖原染色后，胞質中可出現大小不等的紅色團塊或顆粒狀物質。④成骨細胞礦化結節：成骨細胞體外礦化特征，是成骨細胞具備骨形成功能的表現，通常用Von Kossa法、四環素熒光標記法及茜素紅法染色顯示成骨細胞礦化結節[11,16]，四環素標記法染色呈黃色發光結節，經Von Kossa法染色礦化結節呈現黑色。并且，礦化結節計數可反映成骨細胞礦化功能[16-17]。⑤增殖率測定：通過對成骨細胞增殖率測定，反映細胞的生長情況，已被廣泛應用的測定方法是MTT比色法[1]。⑥分泌蛋白測定：成骨細胞具有合成分泌多種蛋白質的功能，是典型的分泌蛋白型細胞，其中胰島素樣生長因子、骨鈣素、轉化生長因子、Ⅰ型膠原與成骨細胞分化以及骨形成功能密切相關[17]。⑦堿性磷酸酶比活性檢測：對堿性磷酸酶比活性檢測可反映成骨細胞的分化程度以及分泌堿性磷酸酶的活性[2]。⑧鈣攝取功能測定：可通過放射性核素標記 45Ca2+對成骨細胞攝取和釋放鈣的功能進行測定[18]。⑨信使RNA測定：通過應用反轉錄-聚合酶鏈反應技術可檢測成骨細胞胰島素樣生長因子、骨鈣素、轉化生長因子、成骨生長肽、Ⅰ型膠原等的信使RNA表達水平，進而反映成骨細胞的功能狀態[8,11,17]。

4 結 語

BMSCs治療骨缺損疾病具有獨特的優越性，使其成為治療骨科疾病合適的種子細胞，為基因治療和細胞移植提供理想材料[2]。但關于BMSCs尚存在一些問題需要解決:①大量擴增后如何保持 BMSCs 的生物學特性[19]；②如何得到較純的BMSCs[1,3]；③如何誘導BMSCs向特定組織細胞分化；④關于控制BMSCs過度增殖、選擇適當移植時機、移植細胞可否整合到相應組織的問題上有待于進一步研究；⑤各種力學條件對BMSCs向特定組織細胞分化的影響，特別是周圍環境的力作用的研究;⑥如何促使BMSCs與材料相容生長并且成骨是當前組織工程研究的焦點[5,7,20]。有關BMSCs誘導分化成骨的研究已有了較大發展，然而多數研究還處在動物體內和體外實驗階段，若對其進行充分認識，還需要臨床大量的研究和人體試驗。

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Research Progress on the Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Osteoblasts

WANGShuai,ZHANGXiao-yan,LIZhe-hai.

(DepartmentofOrthopedics,theThirdAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Baotou014010,China)

Basic research and clinical application of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) are extensive.BMSCs have good potential of differentiating into osteoblasts,and multipotential of differentiation ability,that they can differentiate into bone,cartilage,and adipose tissues.BMSCs can rapidly differentiate into osteoblasts and proliferate under suitable induction of growth factors.Moreover,BMSCs is easy to obtain,separate,expand,and transform of multi-spectrum without apparent immune rejection.BMSCs are the most commonly used cell sources for bone tissue engineering.However,as the application of BMSCs expands,problems such as biological characteristics,isolation and identification,induced differentiation,and clinical applicability of BMSCs are increasing and need further investigation.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation； Bone tissue engineering

R68

A

1006-2084(2015)12-2137-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.009

2014-08-18

2014-11-25 編輯：相丹峰