“氨在肝性腦病發病中的作用”家兔實驗麻醉方法的改良

吳 衛何慧華董 祁

廣州醫科大學 1 病理生理學教研室 2 機能學教研室 3 生理學教研室，廣東省廣州市 511436

“氨在肝性腦病發病中的作用”家兔實驗麻醉方法的改良

吳 衛1何慧華2董 祁3

廣州醫科大學 1 病理生理學教研室 2 機能學教研室 3 生理學教研室，廣東省廣州市 511436

我國各大醫科院校病理生理學傳統的“氨在肝性腦病發病中的作用”實驗中，由于家兔的上腹部大型手術只是在局部麻醉下進行，術中動物掙扎強烈，故此實驗一直受到不少師生的抵觸，個別院校甚至取消了該實驗。本文旨在探討如何將靜脈麻醉方法有效運用于該實驗。適量注射短效巴比妥類藥硫噴妥鈉，輔以局部麻醉，既能保證動物在安靜狀態下上腹部手術的順利完成，又不會明顯影響兔蘇醒后氨的中樞毒性作用的觀察。此改良麻醉方法值得在各大醫科院校推廣。

短效巴比妥類 硫噴妥鈉 急性氨中毒 家兔實驗 肝性腦病

肝性腦病（Hepatic Encephalopathy，HE）是在急、慢性肝病基礎上發生的腦的神經功能紊亂。維也納第11屆世界胃腸病學大會（1998）將肝性腦病分為A型（Acute急性）、B型（Bypass旁路）、C型（Cirrhosis肝硬化）。肝性腦病的發病機制尚不完全清楚，目前主要存在氨中毒學說、假性神經遞質學說及γ－氨基丁酸（GABA）學說等。氨中毒學說認為HE患者血氨升高，過量的氨對腦組織有毒性作用，包括使腦內神經遞質平衡失調、干擾腦細胞能量代謝以及影響神經細胞膜等，最終導致腦功能紊亂。氨中毒學說已成為解釋肝性腦病發病機制的中心環節，與其他學說之間的聯系越來越密切[1］。

1 麻醉方法改良的研究背景

我國各大醫科院校病理生理學及機能實驗學開設的“氨在肝性腦病發病中的作用”本科實驗課，旨在通過阻斷家兔的大部分肝臟血流，使肝功能嚴重損害，再經十二指腸推注復方氯化銨液，致使家兔在短時間內出現類似肝性腦病的典型癥狀。此實驗主要是復制A型肝性腦病（急性肝衰竭相關肝性腦病）的動物模型，是病理生理學也是機能實驗學唯一的一個消化系統疾病整體模型的經典實驗，它不僅可讓醫科學生深刻認識到氨中毒學說在肝性腦病發病中的重要意義，而且通過實驗組（甲兔：大部分肝葉結扎并灌氨）、假手術組（乙兔：肝葉假結扎并灌氨）、生理鹽水組（丙兔：大部分肝葉結扎并灌生理鹽水）的設計以及定量測定各組血氨，可有效地對學生進行初步科研設計思維的訓練。另外，此實驗中包括的諸如荷包縫合、連續縫合、體外心臟穿刺取血等大量操作機會往往大大激發了學生的學習熱情。

為了排除靜脈麻醉藥對氨的中樞毒性作用的干擾，傳統上此實驗的大型上腹部手術是在動物局部麻醉（皮下浸潤麻醉）下施行，因完全不能克服牽拉胃、肝、腸等內臟引起的牽引痛和牽拉反應，術中家兔掙扎異常劇烈，故長期以來不少病理生理學以及機能學的帶教老師、技術員以及實驗學生，對此有非常大的反感甚至抵觸情緒[2］。天津醫科大學病理生理室早已取消了在留學生中開展該實驗課，大連醫科大學十年前已在其留學生教學中將此實驗改為烏拉坦靜脈麻醉[3］。由于醫學科學研究越來越成為一種重塑人性的手段，為了研究疾病的機理，實驗者要在動物身上制造相應疾病的模型。醫學實驗研究中應遵循替代、減少和優化三大動物實驗原則，其中的“優化”原則即指通過改進和完善試驗程序、減少或減輕對實驗動物的不人道操作，把對動物的傷害降到最低限度[4］。具體而言，在動物實驗中，應特別強調使用麻醉劑、無痛方法或者其他免除動物疼痛的方法來減輕實驗給動物帶來的劇烈疼痛[5］。

基于上述研究背景，廣州醫科大學病理生理學及機能實驗學的老師們近年來不斷對戊巴比妥鈉、烏拉坦、硫噴妥鈉等不同的靜脈麻醉藥在此實驗中的應用進行摸索與研究，并取得了突破性的進展。

2 常規靜脈麻醉方法之弊端

2.1 3%戊巴比妥鈉麻醉 常規劑量1ml/kg麻醉下，甲、乙兔不會出現全身陣發性抽搐及強直性痙攣。戊巴比妥鈉為中效巴比妥類，作用維持時間3～6h。巴比妥類的中樞抑制作用主要見于GABA能神經傳遞的突觸，即主要通過延長氯通道開放時間而增加Cl－內流，引起突觸后神經元超極化。由于戊巴比妥鈉的中樞麻醉機制與氨的中樞毒性機制有類似之處，家兔此實驗中又一直處于麻醉狀態，故戊巴比妥鈉會明顯干擾氨的腦毒性作用。

2.2 25%烏拉坦麻醉 常規劑量即4ml/kg麻醉下，甲、乙兔出現撲翼樣震顫、局部及全身陣發性抽搐；減小劑量，如25%烏拉坦2ml/kg麻醉，甲、乙兔出現典型的類似角弓反張的強直性痙攣。傳統觀點認為烏拉坦是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活性，造成乙酰膽堿的積累，影響實驗動物正常的神經傳導而起麻醉作用，故它對中樞的抑制作用小。近年對烏拉坦的麻醉機制研究有了新進展，認為它是一種對多通道產生作用的麻酸劑，不僅加強乙酰膽堿受體功能，還可加強其他抑制性受體如GABA受體功能，同時還抑制興奮性受體[6］。由于烏拉坦使家兔在此實驗中始終處于麻醉狀態，對甲、乙兔癥狀進行解釋時，就很難排除烏拉坦的中樞干擾與影響。更值得一提的是，烏拉坦有潛在的致癌性。毒理學實驗證實烏拉坦有誘導鼠、兔致癌作用，故對人體同樣存在致癌的危險性。早在上個世紀80年代初，我國衛生部就明文規定將烏拉坦從醫用藥品中淘汰，禁用于病人，目前只允許在實驗動物麻醉中使用，手術操作過程中也盡量不用未戴橡膠手套的手過多接觸動物切口上的血液[7］。而“氨在肝性腦病發病中的作用”這個家兔實驗近30min的上腹部大型手術中，實驗者不可避免地要大面積接觸動物腹腔內臟及體液。

3 麻醉方法的改良

如何為本實驗選擇一種合適的靜脈麻醉藥，既能保證家兔在安靜狀態下完成約25min的上腹部手術，又不會明顯影響對氨的中樞毒性作用的觀察。硫噴妥鈉（Thiopental Sodium）為超短時作用的巴比妥類藥物，作用維持時間0.25h，腦中半衰期僅5min，臨床用于短時手術[8］。如果硫噴妥鈉靜脈麻醉下完成家兔上腹部手術，術后家兔蘇醒，蘇醒后再灌注復方氯化銨溶液，是否能順利觀察到中樞氨中毒的典型癥狀？以此思路為出發點，筆者進行了預實驗，并取得良好效果。

3.1 麻醉方法 兔耳緣靜脈緩慢注入2.5%硫噴妥鈉0.6ml/kg（即15mg/kg），上腹部0.2%普魯卡因皮下浸潤麻醉，進腹腔后進行手術期間，如動物有明顯不適，適量0.2%利多卡因表面麻醉。甲兔做大部分肝葉結扎及十二指腸插管術，乙兔做肝葉假結扎及十二指腸插管術。甲、乙兔20～25min后（即手術剛完成）蘇醒（出現主動眨眼、四肢或脖子移動等）。動物蘇醒后，立即灌氨（每隔5min灌2.5%復方氯化銨溶液3ml/kg）。甲、乙兔均出現明顯呼吸加深加快，并漸出現四肢及尾巴的撲翼樣震顫、四肢展伸、局部及全身陣發性抽搐，轉為典型的類似角弓反張的強直性痙攣，最后呼吸停止而死亡。甲兔灌藥4次、乙兔灌藥5次出現強直性痙攣。相同灌氨量的前提下甲兔血氨水平高于乙兔。

硫噴妥鈉有抑制交感神經、興奮迷走神經的作用，易致呼吸抑制，靜脈注射時速度宜緩慢（兔：0.2ml/min）；并可使胃賁門括約肌松弛，易致誤吸和返流，故實驗動物前夜最好禁食。

硫噴妥鈉為強堿弱酸鹽，pKa為7.6，故用生理鹽水（常偏酸）或PBS（中性）配制2.5%硫噴妥鈉溶液時，溶液常呈混懸狀，可用5%NaOH進行微調，一旦溶液變清亮馬上停加NaOH，以免溶液過堿，靜脈注射刺激太大。

局部浸潤麻醉和表面麻醉都屬于局部麻醉。表面麻醉是將穿透力強的局麻藥施用于黏膜表面，使其透過黏膜而阻滯位于黏膜下的神經末梢，使黏膜產生麻醉現象。普魯卡因對黏膜的穿透力弱，而利多卡因穿透力強，故本實驗表面麻醉使用利多卡因。

3.2 改良麻醉方案下此實驗成功的關鍵

3.2.1 切忌隨意靜脈追加硫噴妥鈉：硫噴妥鈉屬于巴比妥類藥物，中樞抑制作用主要見于GABA能神經元，從而與氨的腦毒性機制有類似。如硫噴妥鈉麻醉過量，兔將難以蘇醒，在兔未蘇醒狀態下就灌氨而復制出的氨中毒模型，其癥狀的解釋將很難排除硫噴妥鈉的干擾和影響。硫噴妥鈉的安全用量（兔）為50mg/kg，常規麻醉劑量為15～30mg/kg，但為避免麻醉過深，筆者在此實驗中只采用其下限值15mg/kg。這一靜脈麻醉劑量下可能對痛感的阻斷不夠，故需輔以上腹部皮下浸潤麻醉，術中必要時還可在肝及胃腸等腹腔內臟進行表面麻醉。

3.2.2 局麻藥的使用要適度：用于腹腔內臟表面麻醉的利多卡因，可經腹腔吸收入血，然后透過血腦屏障而抑制中樞，如過量使用，一方面使動物蘇醒延遲，另一方面易誘發氨的腦毒性作用提前出現（機制尚待探討）。臨床上安眠鎮靜藥就是肝性腦病的常見誘因之一。故上腹部手術過程中，實驗員的操作要盡量輕柔，必要時才使用利多卡因，且1只兔最多使用1～2支利多卡因（1支規格為4mg/2ml）。

3.2.3 區分靜脈麻醉藥的麻醉時間和睡眠時間：睡眠時間指術后如不人為叫醒、動物可持續睡眠的時間。硫噴妥鈉是脂溶性極高的藥物，脂溶性高的巴比妥類藥血漿蛋白結合率高，由腎小球濾過較少，也易被腎小球再吸收，其主要消除方式由肝藥酶代謝，因此，肝臟損傷極易使硫噴妥鈉的生物轉化受阻，從而使動物的睡眠時間延長[9］。硫噴妥鈉的麻醉時間為20～30min，但睡眠時間可達70～90min[10］。故術后如兔未及時蘇醒，可適度撥動其身體促進蘇醒。

除麻醉方法的改良及術后兔蘇醒后才開始灌氨，本實驗的其他內容均基本不變。硫噴妥鈉靜脈麻醉輔以局部麻醉的“氨在肝性腦病發病中的作用”實驗，已于2015年上半年在廣州醫科大學本科生機能實驗教學中正式開展，取得良好教學效果的同時，也積累了不少寶貴的經驗教訓，希望本文能為病理生理學及機能實驗學的同仁們起到拋磚引玉的作用。

[1]王建枝，殷蓮華.病理生理學〔M〕.第8版.北京：人民衛生出版社，2013.

[2]黃洪標，董曉先，吳衛.肝性腦病實驗的教學體會與思考－善待實驗動物〔J〕.醫學理論與實踐，2013，26（7）：972－974.

[3]孫藝平，鄒原.醫學機能實驗學（英文版）〔M〕.北京：科學出版社，2009：112－113.

[4]林常清.從醫學生的動物實驗看生命倫理教育〔J〕.醫學與哲學：人文社會醫學版，2010，31（10）：71－72.

[5]馮丹丹，韓仰，向陽，等.在機能實驗教學中加強動物實驗倫理學教育的實踐與思考〔J〕.現代生物醫學進展，2011，11（19）：3777－3779.

[6]楊黎黎，李樹清.烏拉坦麻醉動物的病理生理學作用〔J〕.微循環學雜志，2011，21（1）：59－61.

[7]周榮波.動物麻醉中烏拉坦的安全使用〔J〕.衛生職業教育，2009，27（9）：109－110.

[8]江明性，楊藻宸.藥理學〔M〕.北京：人民衛生出版社，1979.

[9]錢之玉.藥理學實驗與指導〔M〕.北京：中國醫藥科技出版社，2003：8.

[10]高堂成，張春才，康慶林，等.硫噴妥鈉，氯胺酮與安定在實驗兔麻醉中的應用〔J〕.中國比較醫學雜志，2005，14（3）：170.

（編輯雅文）

S
tudy of Intravenous Anesthesia in Rabbit Experiment of Exploring the Role of Ammonia Intoxication in Pathogenesis of Hepatic Encephalopathy

WU Wei＊，HE Huihua，DONG Qi.＊Department of Pathophysiology，Guangzhou Medical University，Guangzhou City，Guangdong Province 511436

The classical medical undergraduate experiment of exploring the role of ammonia intoxication in the pathogenesis of hepatic encephalopathy has been debated for years and even cancelled because in this experiment the rabbit will struggle strongly during the upper abdominal surgery that is carried out only under the local infiltration anesthesia.In this paper，intravenous anesthesia drugs（such as urethane，pentobarbitol sodium）are discussed，with the purpose to discover an appropriate ones to be applied in this experiment.It is suggested that intravenous administration of thiopental sodium（a short－acting barbiturate），combined with local anesthesia，will not only make the rabbit to be more collaborative during the sugery but will also make the neuropsychical manifestations caused by acute ammonia intoxication duplicated after the awakening of rabbit be observed clearly.

Short－acting barbiturate，Thiopental sodium，Acute ammonia intoxication，Rabbit experiment，Hepatic encephalopathy

R－332

A

1001－7585（2015）22－3029－03

2015－06－23