犬細(xì)小病毒寧夏株的分離與鑒定

楊 麗，段相國，劉宏鵬，徐廣賢，郭文偉，張議心，趙 瑾

（寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院 寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗室，寧夏 銀川 750004）

犬細(xì)小病毒寧夏株的分離與鑒定

楊 麗，段相國，劉宏鵬，徐廣賢，郭文偉，張議心，趙 瑾

（寧夏醫(yī)科大學(xué)檢驗學(xué)院 寧夏臨床病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗室，寧夏 銀川 750004）

本試驗采集寧夏地區(qū)疑似犬細(xì)小病毒感染病犬的糞便拭子，經(jīng)過預(yù)處理后同步接種胎貓腎細(xì)胞（FK81），盲傳3代后發(fā)現(xiàn)FK81細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性改變（CPE）。凍融收獲病毒后，對分離出來的病毒進(jìn)行電鏡觀察、間接免疫熒光試驗（IFA）檢測、特異性PCR鑒定及VP2全基因序列擴(kuò)增分析，成功分離培養(yǎng)出1株犬細(xì)小病毒（CPV）。

犬細(xì)小病毒；分離鑒定；FK81；VP2基因

犬細(xì)小病毒（CPV）屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，為無囊膜自主復(fù)制的單股負(fù)鏈線性DNA病毒。CPV會引起犬細(xì)小病毒病（CP），又名犬出血性腸炎，是一種急性烈性傳染病，發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)，死亡率高，是危害中國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。1979年Appel[1]等首次從患出血性腸炎病犬中成功分離出CPV，即CPV-2型。本文主要針對CPV的VP2基因設(shè)計引物來鑒別診斷分離出來的CPV毒株，旨在為后期的CPV單克隆抗體疫苗的研制和分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料 2014年5月中旬采集寧夏某寵物醫(yī)院1只有發(fā)熱、厭食、頻繁嘔吐、劇烈腹瀉癥狀病犬的糞便拭子。將糞便拭子迅速放入每支含有2.5 mL PBS的離心管中，-80℃凍存。PBS含有100 U/mL的雙抗溶液。

1.2 細(xì)胞系、抗體 胎貓腎細(xì)胞系（FK81）由本實(shí)驗室保存，CPV陽性鼠抗血清由實(shí)驗室自己制備。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液，均購自GIBICO公司；青霉素鏈霉素混合液、EDTA-胰蛋白酶消化液，購自北京索萊寶科技有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP，購自天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，購自O(shè)mea公司；T載體，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，羊抗鼠FTIC-IgG熒光抗體，購自Proteintech公司。

1.4 病料的處理 在接毒前將病料反復(fù)凍融3次，

用無菌鑷子將糞便拭子上液體擠干。4℃10 000 r/min離心30min后，吸取上清用0.22μm無菌濾器過濾后，分裝到無菌EP管中，作為待分離病毒樣品，并凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的分離培養(yǎng) 采用同步接毒法，將長成單層的FK81細(xì)胞消化傳代的同時，加入500μL待分離病毒樣品,即按培養(yǎng)液量體積的1/10接毒。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，換維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)立未接毒的空白對照。培養(yǎng)期間每天觀察細(xì)胞毒性病變（CPE）。接毒3～4 d后，將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，12 000 r/min（4℃）離心后，取上清繼續(xù)接毒培養(yǎng)，待FK81出現(xiàn)90%以上CPE時收毒，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病毒基因組提取 按照OMEGA DNA提取試劑盒說明書分別提取第3代收獲病毒液DNA和空白對照組FK81細(xì)胞的DNA。

1.7 特異性基因和VP2基因全序列的擴(kuò)增 PCR鑒定引物1參照文獻(xiàn)[2]合成；VP2基因全序列擴(kuò)增引物2根據(jù)Gene Bank上發(fā)表的CPV VP2基因序列利用Primer5.0設(shè)計合成。兩對引物都在北京三博遠(yuǎn)志生物科技有限責(zé)任公司合成。引物序列如表1所示。

表1 寡居核苷酸引物

PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×Buffer 5μL，dNTP4 μL，上游引物1μL，下游引物1μL，Taq DNA聚合酶1μL，模板2μL，ddH2O 36μL。209 bp片段PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30 s，55℃30 s，72℃

30 s，35個循環(huán)；72℃延伸8min。1 755 bp片段PCR反應(yīng)條件：96℃4min；96℃1min，52℃1min，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸8min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL電泳檢測結(jié)果。

用OMEGA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與T載體連接轉(zhuǎn)化后，送北京生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.8 電鏡拍攝病毒粒子取收獲的第3代病毒液，滴1滴于銅網(wǎng)上晾干后，再滴一滴2%磷鎢酸負(fù)染，電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)和大小。

1.9 間接免疫熒光（IFA）試驗 在96孔板接種1× 104細(xì)胞，并同步接毒1/10體積病毒液，培養(yǎng)72 h后，棄去上清，用PBS洗3遍，用預(yù)冷（-20℃）甲醇固定20min，待自然風(fēng)干后，加入一抗100μL，37℃孵育1 h，PBS洗滌3遍，加FTIC標(biāo)記的二抗100μL，37℃孵育1 h，PBS洗滌后，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。同時設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 處理過的病料同步接毒于FK81細(xì)胞后盲傳至第3代，與接毒前FK81細(xì)胞相比，90%以上細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，出現(xiàn)明顯的CPE。試驗結(jié)果記錄了接毒前、接毒24 h、接毒48 h、接毒72 h FK81細(xì)胞的形態(tài)變化，見圖1。

圖1 FK81細(xì)胞接種CPV后的細(xì)胞病變A：接毒前FK81細(xì)胞；B：接種CPV 24 h后FK81細(xì)胞CPE；C：接種CPV 48 h后FK81細(xì)胞CPE；D：接種CPV 72 h后FK81細(xì)胞CPE

2.2 電鏡鑒定結(jié)果 電鏡負(fù)染可觀察到第3代病毒收獲液中呈現(xiàn)立體對稱、圓形、無囊膜，直徑在20～25 nm之間的實(shí)心病毒粒子，如圖2所示。

2.3 特異性基因和VP2全基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 CPV病毒粒子負(fù)染照片

提取第3代病毒液的病毒基因組DNA和未接毒的FK81細(xì)胞的基因組DNA（陰性對照），PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在209 bp、1 755 bp處出現(xiàn)與預(yù)計大小一致的目的片段，見圖3、圖4。

2.4 間接免疫熒光試驗（IFA）檢測結(jié)果 CPV感染FK81細(xì)胞72 h后，IFA試驗結(jié)果表明，病毒在FK81細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，并且集中在細(xì)胞核周圍。如圖5所示，特異性綠色熒光主要集中在細(xì)胞核周圍。陰性對照組無特異性綠色熒光出現(xiàn)。

3 討論

CP是危害犬類的最主要的烈性傳染病之一，給養(yǎng)犬業(yè)和寵物愛好者帶來了嚴(yán)重的危害和精神損失。且隨著CPV病毒的不斷變異，市場上的疫苗保護(hù)力逐漸減弱或者失去保護(hù)力，這使得對CPV的研究和新型疫苗的制備更加迫在眉睫。

圖3 特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果 （209 bp）M：DL-2 000Marker；1、2：第3代病毒液擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陰性對照

圖4 VP2全基因擴(kuò)增結(jié)果 （1 755 bp）M：DL-2 000Marker；1：第3代病毒液擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對照

圖5 間接免疫熒光檢測CPV在FK81細(xì)胞中復(fù)制A：接種CPV的FK81細(xì)胞；B：A的局部放大圖

本試驗采集寧夏地區(qū)某寵物醫(yī)院疑似CPV感染的病犬糞便拭子，對病料進(jìn)行處理后，同步接毒FK81細(xì)胞后，第1代細(xì)胞形態(tài)無任何改變，盲傳至第2代少數(shù)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，盲傳至第3代后90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE，此時收毒-80℃凍存?zhèn)溆?。試驗選擇CPV病毒易感的FK81細(xì)胞作為分離病毒的細(xì)胞系，使得病毒分離成功的幾率提高，且病毒產(chǎn)生的CPE病變?nèi)菀子^察判斷。選擇同步接毒的原因是CPV病毒完全依賴宿主細(xì)胞DNA的復(fù)制機(jī)制進(jìn)行復(fù)制,復(fù)制主要在細(xì)胞周期的S期晚期和G2早期。

將分離的第3代病毒液用2%磷鎢酸負(fù)染后，電鏡觀察可以看到圓形、無囊膜，直徑在20～23 nm之間的CPV病毒粒子。電鏡觀察是從形態(tài)學(xué)方面對CPV進(jìn)行直觀、準(zhǔn)確的鑒定，操作方法簡便，省時省力，是CPV病毒常用的診斷方法之一。

提取第3代病毒液DNA,進(jìn)行PCR特性鑒定和VP2基因全長擴(kuò)增，均得到了與預(yù)期大小一致的目的片段，且測序結(jié)果與CPV基因序列比對后高度相符，更加證明了病毒鑒定的準(zhǔn)確性。PCR鑒定方法和實(shí)驗室其他常規(guī)鑒定方法相比，PCR鑒定更為精確，可以排除其他同屬病毒的干擾，增強(qiáng)了鑒定的特異性、準(zhǔn)確性。

病毒同步接種單層FK81細(xì)胞72h后，用間接免疫熒光試驗檢測CPV病毒在FK81細(xì)胞中的復(fù)制情況，發(fā)現(xiàn)特異性綠色熒光主要集中在FK81細(xì)胞核周圍。此法簡便、快速、檢出率較高，許多國家和地區(qū)已將該法作為CPV的法定診斷方法，也是我國實(shí)驗室診斷CPV最常用的定性方法之一[3]。

本試驗用實(shí)驗室常用的CPV診斷方法進(jìn)行分離鑒定，成功分離鑒定出1株CPV毒株，為以后CPV新疫苗的研究即單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)，豐富了流行病學(xué)資料，也為本實(shí)驗室進(jìn)行CPV單克隆抗體新型診斷試劑盒的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Appel，M JG，Scott FW，et al.Isolation and immunization stud?ies of a canine parvo-like virus from dogswith hemorrhagic enter?itis[J].VetRec，1979，105：156-159.

[2]祝文琪，徐衛(wèi)康，陸彥，等.犬細(xì)小病毒熒光定量PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（5）：17-20.

[3]徐鈺，劉劍郁，解林紅，等.犬細(xì)小病毒診斷與防制研究進(jìn)展[J].四川動物，2013，32（3）：475-479.

S852.65

A

0529-6005（2015）11-0055-03

2015-06-16

楊麗（1990-），女，碩士生，主要從事臨床病原微生物與免疫學(xué)檢驗方面研究，E-mail：125389191@qq.com

徐廣賢，E-mail：xgx205079@sina.com