豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的原核表達和間接ELISA方法的建立

王麒文，張鶴曉，高志強，林祥超，張樂萃

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的原核表達和間接ELISA方法的建立

王麒文1，張鶴曉2，高志強2，林祥超1，張樂萃1

（1.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109；2.北京出入境檢驗檢疫局，北京 朝陽 100026）

根據豬繁殖與呼吸綜合征病毒JX株編碼N蛋白的ORF7基因序列設計特異性引物。采用RT-PCR方法擴增豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因片段（367 bp），將其克隆于表達載體pET-32a上。測序驗證后將重組質粒pET-32a-JX-N轉入宿主菌Rosetta，經0.7mmol/L IPTG誘導，SDS-PAGE顯示外源基因編碼的重組N蛋白在宿主菌中表達效率較高。Western-Blot試驗結果顯示，重組N蛋白具有反應原性。將純化的重組N蛋白包被酶標板，建立并優化了能夠用于PRRSV抗體檢測的間接ELISA方法。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；N蛋白；重組表達；間接ELISA

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的，對豬有極強感染性的免疫抑制性傳染病。1996年中國境內首次分離到美洲型PRRSV[1]。一直以來PRRSV主要危害的是妊娠期的母豬和仔豬，在2006年變異的PRRSV（HPPRRSV）顯示出了更強的致病性，除了妊娠期的母豬和仔豬以外，包括公豬在內的其他豬只也會因感染本病毒而死亡[2-3]。PRRSV含有一個單股正鏈RNA基因組，它的全長包含有9個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2-ORF7），其中ORF7編碼的N蛋白在流行的毒株中，具有較高的保守性，可與大多數美洲株和歐洲株病毒抗體起反應[4]。

抗體依賴的病毒感染增強作用（ADE）[5]以及PRRSV導致機體產生的持續性患病和免疫抑制，造成病豬發生嚴重的繼發性和持續性感染，從而使臨床癥狀出現多樣化。因此建立準確而有效的PRRS檢測方法，有利于制定有效的PRRSV防控策略。

本研究應用原核表達并純化的PRRSV JX株N蛋白作為包被抗原，建立并優化了能夠有效檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Taq DNA聚合酶，限制性內切酶Bam HI，Hind III，質粒提取試劑盒，T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；TRIZol，購自Invitrogen公司；M-MLV反轉錄酶，購自Promega公司。

1.2 病毒、宿主菌、質粒和陽性血清 豬繁殖與呼吸綜合征病毒JX株，原核表達質粒pET-32a，動物疫病診斷聯合實驗室保存；大腸桿菌（E.coli）Rosetta，Top10，購自北京康為世紀生物科技有限公司；PRRSV陽性血清，本實驗室保存。

1.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7基因擴增參照JX株PRRSV編碼N蛋白的ORF7基因序列設計一對引物，設計的引物名稱、序列見表1。

表1 PRRSV的引物名稱和序列

提取JX株豬PRRSV核酸進行RT-PCR擴增，擴增條件如下：30℃5min，42℃60min，70℃15min，94℃預變性3min后進入擴增循環，循環參數是94℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸50 s，30個循環后，72℃延伸10min。擴增目的片段-20℃保存。

1.4 原核表達載體構建與測序分析 對于表達載體pET-32a和上述目的片段，分別使用限制性內切酶BamH I，Hind III在37℃條件下作用5 h，之后在16℃條件下用連接酶連接過夜后，轉化至Top10感受態細胞，涂板后挑取單菌落，菌落PCR鑒定后送測序。將序列比對正確的陽性菌進行擴大培養后提取質粒，并命名為pET-32a-JX-N。

1.5 重組N蛋白的表達與純化 將提取的pET-32a-JX-N重組質粒轉化至Rosetta表達工程菌種中，在恒溫空氣震蕩搖床中進行擴大培養。在菌液OD600nm

值為0.6時加入一定濃度的IPTG，在加入IPTG前取少量菌液作為未表達的陰性對照。取誘導后以及未誘導的菌體進行裂解煮樣后，進行SDS-PAGE電泳，根據考馬斯亮藍染色結果來判定重組蛋白是否表達，并通過改變重組蛋白誘導表達過程中誘導時間、IPTG的終濃度及培養溫度等條件來改變該重組蛋白表達性質，以期獲得最佳表達條件。

對于收集的菌體利用超聲進行裂解，取裂解產物上清通過His·Bind試劑盒進行純化。

將純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，并將目的條帶電轉至硝酸纖維素膜，以PRRSV感染的豬血清作為一抗進行Western-Blot檢測，根據反應結果來判定該重組蛋白的反應原性。

1.6 重組N蛋白間接ELISA方法的建立 本研究中利用棋盤滴定法分別對抗原包被濃度及包被條件，最佳封閉液種類及一抗稀釋度，二抗稀釋度等條件進行了優化。

1.7 陰陽性臨界值的確定 在摸索的間接ELISA方法最佳條件下，隨機檢測30份臨床PRRSV抗體陰性血清，顯色后讀取OD450nm值，計算30份陰性血清OD450nm的平均值（-x）和標準差（SD），以-x+3SD作為該方法判定陰陽性的臨界值，即當待檢血清OD450nm值高于此臨界值時判為陽性，否則為陰性。

1.8 重復性試驗 分別選取5份陽性及陰性PRRSV血清樣品進行檢測，每個血清重復3個酶標孔，用同一次包被的酶標板進行板內重復性試驗；另外將重組蛋白分別在不同時間段包被酶標板，同樣分別利用5份PRRSV陰陽性血清作為一抗，檢測板間重復性，分別計算板內和板間變異系數。

1.9 特異性試驗 用建立的間接ELISA方法分別檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、口蹄疫病毒、豬流行腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬瘟病毒的陽性血清，判定該方法對于檢測PRRSV抗體的特異性。

1.10 間接ELISA符合率試驗 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測30份豬血清樣品，同樣條件下用IDEXX公司的PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒進行重復性檢測。并對檢測結果進行以下處理，統計二者檢測的陽性數與二者檢測的陰性數，相加后與檢測總數相除得到符合率。

1.11 間接ELISA與中和試驗比較 利用中和試驗測定30份豬血清樣品的中和效價，同時對這30份豬血清樣品從1∶2依次倍比稀釋至1∶256后用本試驗所建立的間接ELISA方法進行檢測，測得其ELISA效價，與先前的中和效價進行比較分析。

2 結果

2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白基因片段擴增結果 對PRRSV編碼N蛋白的ORF7基因片段進行RT-PCR擴增，1.25%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，RT-PCR擴增產物與預期大小（367 bp）一致（圖1）。

圖1 RFF7基因片段RT-PCR擴增結果1：目的片段RT-PCR擴增結果；M：DL-2 000DNA分子Marker

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白原核表達重組載體構建及質粒序列分析 目的片段和表達載體pET-32a分別經BamH I，Hind III進行雙酶切后，連接并轉化后，挑取單菌落送去公司測序，經過比對分析，該測序結果與與預期結果一致。將測序正確的陽性菌進行擴大培養后成功提取了pET-32a-JX-N質粒。

2.3 豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的誘導表達與純化 重組質粒轉化至Rosetta工程菌，挑取單菌落進行擴大培養，并擴大至200mL含有氨芐的LB液體培養基中進一步擴大培養，當OD600nm值升至0.6后，加入終濃度為0.7mmol/L的IPTG，在37℃空氣搖床中進行5 h的誘導表達。SDSPAGE結果顯示，該重組蛋白在此誘導條件下主要為上清表達，且經過考馬斯亮藍染色后在30 kDa處可見目的蛋白條帶（圖2）。使用His·Bind試劑盒純化后得到高純度的目的蛋白（圖3）。

經過Western-Blot檢測，根據蛋白Marker判定在約30 kDa處有預期條帶（圖4）。表明該重組N蛋白的反應原性較好。

2.4 重組N蛋白間接ELISA方法的建立 對于建立ELISA過程中的各個條件進行摸索，優化結果如下：抗原最佳包被濃度為0.64μg/mL，最佳包被條件為37℃作用2 h加4℃過夜；較為理想的封閉液為5%脫脂奶；合適的血清稀釋度為1∶80；HRP標記的rec Protein G按照1∶1 000倍稀釋最佳。

2.5 臨界值的確定 經對30份PRRSV陰性血清進行測定，確定樣本臨界值為0.32。

圖2 SDS-PAGE電泳結果M：低分子量蛋白Marker；1：未經IPTG誘導的菌體上清；2：經IPTG誘導的菌體上清；3：未經IPTG誘導的菌體沉淀；4：經IPTG誘導后的沉淀

圖3 純化后的重組蛋白M：低分子量蛋白Marker；1：純化后的重組蛋白

圖4 Western-Blot試驗結果

2.6 重復性試驗 經測定計算，板內變異系數為1.07%～5.67%，板間變異系數為1.16%～4.27%，均小于10%，證明該方法重復性良好。

2.7 特異性試驗 特異性試驗的結果顯示：豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性血清OD450nm值高于臨界值，為陽性。檢測的PCV-2、FMDV、PEDV、TGEV和CSFV陽性血清OD450nm值均小于0.32，為陰性。

2.8 間接ELISA符合率試驗 根據本研究建立的間接ELISA方法在檢測30份豬血清臨床樣本的基礎上，同時用IDEXX公司的PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒進行對照，對比得出二者的符合率為93%。對于30份豬血清臨床樣本檢測結果見表2。

表2 N蛋白間接ELISA與IDEXX檢測結果比較

2.9 間接ELISA與中和試驗比較 對30份豬血清同時使用本研究建立的間接ELISA方法和中和試驗進行抗體檢測，統計結果見表3。

表3 N蛋白間接ELISA與中和試驗檢測結果比較

3 結論與討論

本試驗對于N蛋白進行了重組表達并利用其作為包被抗原，建立了可用于PRRSV抗體檢測的間接ELISA方法。

中國境內流行的PRRSV主要為美洲株，國內趙耘等鑒定到歐洲型PRRSV分離株的存在[6]，因而作為間接ELISA方法檢測用的包被抗原N蛋白是首選蛋白。

在間接ELISA方法建立過程中，通過對反應條件的探索，初步建立了針對PRRSV抗體的間接ELISA方法，對于檢測過程中發生假陽性的現象，通過調整PBST洗滌次數，由初期洗滌3次改為洗滌5次，產生假陽性的現象明顯減少，同時板內變異系數也相應降低。究其原因主要是對于每個試驗孔用PBST洗滌5次比洗滌3次更加徹底，前者能夠降低非特異性結合現象的發生，從而增加了檢測的準確性。

對30份豬血清樣品，同時利用本研究所建立的間接ELISA方法和中和試驗檢測PRRSV抗體的結果，經過統計分析后顯示二者沒有相關性。其主要原因是豬在感染PRRSV后1周左右就能產生特異性抗體，但這些抗體并非中和抗體，中和抗體產生較晚，而且機體產生量較低。中和試驗只能檢測機體產生的中和抗體，這也就解釋了檢測結果中間接ELISA方法檢測結果為陽性而中和試驗檢測為陰性的現象。

間接ELISA符合率試驗顯示，本研究建立的間接ELISA方法與進口試劑盒具有較高的符合率，有望應用于PRRSV抗體的臨床檢測和流行病學調查，同時重組N蛋白的表達和純化也為單克

隆抗體的制備打下了基礎。

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S852.65+1

A

0529-6005（2015）11-0049-03

2015-06-11

質檢公益性行業科研專項“動物疫病核酸標準物質制備關鍵技術研究（201310253）

王麒文（1990-），男，碩士生，研究方向為動物檢驗檢疫，E-mail：13718231269@163.com

張樂萃，E-mail：lczhang@qau.edu.cn