嗜酸乳桿菌胞外多糖對TGEV感染ST細胞分泌IFN-γIL-6 IL-8的影響

王瑩瑩，劉文娜，魏 萍，王子敬，張 萍

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

嗜酸乳桿菌胞外多糖對TGEV感染ST細胞分泌IFN-γIL-6 IL-8的影響

王瑩瑩，劉文娜，魏 萍，王子敬，張 萍

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為研究抗病毒嗜酸乳桿菌菌株的細胞機制，利用嗜酸乳桿菌胞外多糖（EPS）作用于豬睪丸細胞（ST），以MTT法檢測其是否抑制豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染，并觀察IFN-γ、IL-6、IL-8的mRNA表達水平。本試驗分為4組，分別是正常細胞對照組（Control組）、TGEV感染組（TGEV組）、EPS預處理感染TGEV組（EPS+TGEV）組和胞外多糖組（EPS組），在2、4、6、12、24 h時采集細胞樣品，通過熒光定量PCR方法檢測不同時間點各組細胞中IFN-γ、IL-6、IL-8 mRNA的表達量。結果發現，EPS具有抑制TGEV感染ST細胞的效應；EPS組、TGEV組和EPS+TGEV組IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表達量較Control組比都相對增加，三種細胞因子隨著時間的延長，均呈現出先快速增加后減少回歸到正常水平的趨勢。EPS+TGEV組在感染2 h時IL-8mRNA表達量達到最大值，4 h時IL-6、IFN-γmRNA表達量達到最大值，且均出現了疊加效應，相比正常細胞對照組差異極顯著（P＜0.001）。結果表明，EPS對TGEV感染ST細胞有一定的抑制作用，提高了抗TGEV感染初期IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表達水平。

嗜酸乳桿菌胞外多糖；TGEV；ST細胞；細胞因子

大量研究表明，某些益生菌胞外多糖安全無毒，具有免疫調節、抗腫瘤、降膽固醇、抗氧化等作用[1]。也有報道某些胞外多糖具有抗病毒作用。例如，紫球藻胞外多糖在體外具有抗乙肝病毒作用[2]。嗜酸乳桿菌胞外多糖是嗜酸乳桿菌在生長代謝過程中形成的位于細胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖。盡管對嗜酸乳桿菌胞外多糖的免疫調節研究很多，但是關于它的抗病毒研究甚少，尤其是抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）。TGEV可引起豬傳染性胃腸炎，該病是豬的一種高度接觸性和急性傳染病，致死率很高，對于該病的防治極其重要。

病毒感染細胞會引起一系列的反應，細胞因

子在抵抗病毒感染的過程中發揮重要作用[3]。IL-6是由免疫細胞和非免疫細胞產生的多效性細胞因子，刺激機體的免疫應答[4]。IL-8是一種重要的趨化分子，能夠招募和激活周圍的巨噬細胞、淋巴細胞等。IFN-γ具有廣譜抗病毒活性，可以抑制病毒感染過程中蛋白質的復制。

本試驗通過評價TGEV感染ST細胞中IL-6、IL-8、IFN-γ表達量的變化經EPS對ST細胞處理前后的變化規律，進一步闡明嗜酸乳桿菌胞外多糖在抗病毒過程中調節免疫應答的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 TGEV TO163株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所劉長明研究員惠贈；嗜酸乳桿菌由本實驗室分離、鑒定保存；ST細胞由本實驗室保存；SYBR?qPCR Mix試劑盒，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；HiScript?1st Strand cDNA Synthesis kit，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT），購自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量PCR儀ABI7500等。

1.2 方法

1.2.1 EPS的粗提取 在MRS液體培養基中接種試驗菌種，37℃厭氧培養18～24 h。菌上清液離心、除蛋白、醇沉獲得粗多糖溶液[5]。

1.2.2 EPS的最大無毒劑量 采用MTT法[6]測定。

1.2.3 EPS的抗病毒效果測定 使用已過濾除菌最大無毒劑量的EPS與100TCID50/0.1 mL TGEV（TCID50：10-5.84）等體積加入長成單層細胞的96孔板中，采用MTT法測定[7]。

病毒抑制率=（胞外多糖預處理組平均OD值-病毒對照組平均OD值）/（細胞對照組平均OD值-病毒對照組平均OD值）×100%。

1.2.4 TGEV感染ST和試驗分組 ST細胞以2.0×105個/mL的密度接入6孔板，細胞長滿單層后待用。實驗分為正常細胞對照組、TGEV感染組、EPS預處理感染TGEV組、EPS對照組。EPS作用細胞2 h后，棄去上清，D-hanks洗3遍，加入TGEV，作用1 h，去掉吸附液，加入DMEM細胞維持液繼續培養。分別在病毒感染細胞2、4、6、12、24 h后，棄上清，PBS洗細胞2次，收集細胞，直接提取細胞的RNA或放-80℃備用。

1.2.5 引物的設計與合成 根據GenBank中豬的IL-6、IL-8、IFN-γ基因及參考基因β-actin的序列，設計特異引物并合成（見表1）。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 標準品質粒的構建 按照Fast200試劑盒提取細胞RNA，以RNA為模板，按照HiScript?1st Strand cDNA Synthesis kit反轉錄，合成的cDNA于-20℃保存備用。對目的及內參基因進行常規PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，與pMD18-T載體連接、轉化大腸桿菌感受態細胞DH5-α，基因克隆，提取質粒，篩選陽性質粒送測序公司測序，提取的質粒10倍倍比稀釋10個稀釋度，每個稀釋度設3個平行，-80℃保存備用。

1.2.7 標準曲線的繪制 按SYBR?qPCRMix試劑盒說明，建立20 uL實時熒光定量PCR反應體系，β-actin、IL-6、IL-8、IFN-γ退火溫度分別為60℃、60℃、55℃、59℃，PCR反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，退火30 s，72℃延伸40 s，40個循環。以稀釋好的質粒為模板，PCR儀檢測后，根據Ct值，取5個點繪制標準曲線。

1.2.8 目的基因實時熒光定量PCR檢測 將不同處理組不同時間點的目的及內參基因以cDNA為模板進行熒光定量PCR的檢測，反應條件同上。

2 結果

2.1 EPS的最大無毒劑量 EPS劑量測定發現，在劑量低于原劑量10-3時細胞存活率與空白組接近。確定最大無毒劑量為10-3稀釋度。

2.2 EPS的抗病毒效果測定 MTT法結果顯示，EPS的病毒抑制率為45.65%（見表2）。

2.3 標準品質粒的制備 內參與目的基因PCR擴增，得到與預期大小一致的擴增產物（見圖1）。序列測定證實成功構建了質粒標準品。

表2 OD490結果

圖1 內參及目的基因PCR擴增結果（M：Marker；-：陰性對照；A：β-actin；B：IL-6；C：IL-8；D：IFN-γ）

2.4 標準曲線的建立 根據Ct值儀器制作標準曲線、擴增曲線（見圖2）、熔解曲線。標準曲線線性關系良好，相關系數R2均大于0.98（見圖3）。熔解曲線表明，4種分子均出現特異性單峰（見圖4）。

2.5 目的基因實時熒光定量PCR檢測 TGEV組、EPS+TGEV組、EPS組在作用初期均能刺激IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相對表達的增加且EPS+ TGEV組出現了疊加效應。隨著時間的延長，基因表達回歸到正常水平。TGEV組在4 h時IL-6和IL-8基因表達達到最大值，6 h時IFN-γ達到最大值；EPS組在2 h時IL-6達到最大值，4 h時IL-8達到最大值，6 h時IFN-γ達到最大值；EPS+TGEV組在2 h時IL-8達到最大值，4 h時IL-6、IFN-γ達到最大值（見圖5）。

3 討論與結論

圖2 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實時熒光定量PCR擴增曲線

圖3 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實時熒光定量PCR標準曲線

圖4 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實時熒光定量PCR熔解曲線

圖5 不同時間點不同處理組IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相對表達量的變化

已經證明嗜酸乳桿菌及其培養上清均具有抗病毒作用[8]。但培養上清里具體是哪1種物質起到了抗病毒作用尚未解決。本試驗我們粗提了1株嗜酸乳桿菌的胞外多糖，并測定了EPS的最大無毒劑量，以該劑量作用ST細胞，發現提取的EPS具有一定的抗TGEV的作用。熒光定量PCR結果通過雙ΔΔCt法分析表明，TGEV和胞外多糖都可以增加ST細胞IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表達，不同時間點表達量不同。EPS＋TGEV組在作用ST細胞初期可以明顯增加IL-6、IL-8、IFN-γ mRNA的表達，出現疊加效應，促進細胞的免疫活性，增強細胞對TGEV的抵抗力。IL-6、IL-8、IFN-γ隨著試驗時間的延長，表達量均趨向于正常細胞對照組，表明EPS只是暫時性地誘導3種細胞因子的表達，這使EPS既可以增強細胞的免疫功能，又不會引起免疫過度，造成損害。細胞抵抗病毒感染是一個復雜的過程，后續我們將對該胞外多糖抗病毒活性和抗病毒機制做更深入的研究。

結論：EPS具有一定的抗TGEV能力，在作用ST細胞初期增加IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表達，刺激細胞的免疫，增強細胞對TGEV的抵抗力。

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Expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells infected w ith TGEV and on the intervention of Lactobacillus acidophilus extracellular polysaccharides

WANG Ying-ying，LIUWen-na，WEIPing，WANG Zi-jing，ZHANG Ping
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To study the antiviralmechanism of Lactobacillus acidophilus，we treated ST cellswith EPS.MTT assay was used to verify EPSanti-TGEV effect.Detection of the expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 were performed.The studywere divided into four groups：control group，TGEV group，EPSwith TGEV group，and EPSgroup.We collect the cells at 2 h，4 h，6 h，12 h，and 24 h after cellswere treated differently，and then analyzed themRNA expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells at different time points and different treatmentgroups by Real-time PCR.Itwas found that EPSeinhibited TGEV infection in ST cells.IFN-γ，IL-6，and IL-8mRNA expressions in EPSgroup，TGEV group，and EPS+TGEV group were relatively higher than those in the control group.With the extension of time，themRNA expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8 all showed a trend：first increase，then a decrease，and back to normal levels.In EPS+TGEV group，themRNA expression of IL-8 reached its peak at 2 h，and IFN-γ and IL-6 reached theirmaximum at 4 h.Our data show that EPS can enhance the ability of ST to inhibit TGEV by the increased expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8.

EPS；TGEV；ST cells；cytokines

WEIPing

Q939.11+7

A

0529-6005（2015）11-0045-04

2015-01-27

黑龍江省教育廳重點項目（12521z001）；哈爾濱科技局項目（2014RFXGJ096）

王瑩瑩（1988-），女，碩士生，研究方向為益生菌抗豬胃腸道病毒，E-mail：825365352@qq.com

魏萍，E-mail：weiiping@163.com