野菊花水煎劑對免疫應激雞血清ACTH和CORT含量及下丘腦CRH m RNA表達影響

于文會，姜 龍，蘇 景，鄒佳妤，李子佳，姜曉文

（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省動物疫病預防與控制中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

野菊花水煎劑對免疫應激雞血清ACTH和CORT含量及下丘腦CRH m RNA表達影響

于文會1，姜 龍1，蘇 景2，鄒佳妤1，李子佳1，姜曉文1

（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省動物疫病預防與控制中心，黑龍江 哈爾濱 150030）

為了研究野菊花水煎劑對實驗性免疫應激雞血清中，促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質酮（CORT）含量及下丘腦中促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）mRNA表達水平的影響。試驗分為空白組、對照組和野菊花組，平均每組80只雛雞。野菊花組于30日齡口服野菊花水煎劑，早晚兩次，連續7 d。對照組和野菊花組32日齡胸肌肉注射接種10羽份的新城疫Ⅰ系疫苗，造成實驗性免疫應激，空白組注射等量生理鹽水。每組分別于免疫接種后1、3、5、7、14、21 d隨機抓取10只雞心臟采血并取下丘腦。雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測免疫應激后血清中ACTH和CORT的含量；實時熒光定量PCR法測定下丘腦CRHmRNA的表達水平。結果顯示，野菊花能顯著抑制血清中ACTH和CORT的含量及下丘腦中CRHmRNA的表達，對免疫應激有較好的緩解作用。

野菊花；免疫應激；雞；激素；mRNA

現代化畜禽養殖過程中，疫苗對保護動物的健康生長起著至關重要的作用。但疫苗作為一種特殊的免疫刺激因子，同時也會引起免疫應激。免疫應激會對動物的免疫功能、物質代謝、生長生產性能等有廣泛的不良影響，甚至會引起動物死亡[1-2]。現在常用抗免疫應激飼料添加劑來緩解免疫應激，主要包括維生素、糖類、有機酸、電解質和抗生素等[3]。有關中藥抗畜禽的免疫應激研究與應用還較少，中藥是一種相對“綠色”的藥物，擅長調節機體平衡。野菊花具有清熱解毒、疏風平肝的功效，現代藥理學研究表明，其有抗微生物、抗炎、免疫調節等多種作用[4]。本文通過探討野菊花在抗免疫應激中的作用與效果，為今后中藥緩解畜禽免疫應激的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 野菊花，購自哈爾濱中藥材市場；雞新城疫Ⅰ系苗為乾元浩生物股份有限公司生產，批號：獸藥生字（2010）010082073；雞促腎上腺皮質激素ELISA檢測試劑盒和雞皮質酮ELISA檢測試劑盒，購自卡爾文生物科技有限公司；TRIZol Reagent為美國Invitrogen life technologies公司生產；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；ABI 7500 Real-Time PCR擴增儀。

1.2 野菊花水煎劑的制備 野菊花1 500 g，蒸餾水浸泡1 h，頭煎45min、二煎30min、三煎15min，將3次所得煎液混合后，1 500 r/min離心5min，取上清液濃縮至3 000mL，濃度為0.5 g生藥/mL。自動包裝機裝袋密封，4℃保存。

1.3 試驗設計及飼養管理 試驗選取1日齡的海藍公雞雛200只，常規飼養至30日齡淘汰體重偏大偏小的雞，選取平均體重265 g±5 g的雞180只隨機分為空白組、對照組和野菊花組，各組間實驗前體重差異不顯著，每組平均80只雛雞。野菊花組從30日齡早晚兩次各口服1mL野菊花水煎劑，連續7 d。對照組和野菊花組32日齡胸肌肉注射接種10羽份NDⅠ系疫苗,空白組注射等量的生理鹽水

雛雞環境溫度控制為第1周35℃～37℃，以后每周降2℃，最后控制在30℃左右，直至試驗結束。1～3日齡全天給予光照；4～14日齡每天減少1 h直到13 h；15～21日齡每天減少0.5 h直到9.5 h；4周齡每天9 h；5周齡至試驗結束每天8 h，光照強度10 lux。自由采食全價飼料和自由飲水。

1.4 樣本的采集與處理 分別于雛雞免疫后1、3、5、7、14、21 d每組取10只雞，5mL注射器心臟采血，室溫靜置促其凝固，2 000 r/min離心5～10 min得上清，-80℃保存。取下丘腦于-80℃保存。

1.5 檢測方法

1.5.1 雞促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質酮（CORT）的測定 采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗，每樣重復3次。

1.5.2 RT-PCR法測定雞下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）mRNA的表達：（1）mRNA引物的設計與合成：CRH上游引物:5′-GAC CTG ACT TTCCAC CTG CT-3′，下游引物:5′-CCTCAC TTC CCG ATG ATT TC-3′產物長度110 bp；β-actin上游引物：5′-GCC CAT CTA TGA AGG CTA CG-3′，下游引物:5′-GCTGTGGTGGTG AAGCTG TA-3′產物長度123 bp；（2）總RNA的提取及模板cDNA的合成：按照TRIZol試劑盒說明書從下丘腦中提取總RNA。測定各樣品的總RNA濃度及A260/ A280的比值，比值在1.8～2.0之間時可用。模板cDNA的合成添加試劑按照說明書要求，反應條件為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃；（3）實時熒光定量PCR反應條件的確定及樣品的檢測：反應條件采取兩步法PCR擴增程序：第一步預變性：95℃，30 s；第二步PCR反應：40循環，95℃，5 s；60℃，34 s。每個樣品做3孔重復試驗。用2-△△Ct法計算CRH分子mRNA相對表達量。

1.6 統計方法 應用SPSS 19.0統計軟件，各組之間進行單因素LSD法方差分析，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。采用Microsoft Excel 200-7軟件作圖。各組數據采用均數±標準差表示（X±S）。

2 結果

2.1 免疫應激對ACTH和CORT濃度的影響 由表1可知，免疫應激后的第1天對照組與空白組比較差異極顯著（P＜0.01），野菊花組差異顯著（P＜0.05）；第3天對照組、野菊花組與空白組比較差異顯著（P＜0.05）；第5天時，對照組與空白組比較仍有顯著差異（P＜0.05），野菊花組與對照組比較顯著降低（P＜0.05）；到第7天往后，各組無顯著差異。

由表2可知，免疫應激后的第1～3天，對照組和野菊花組血清中CORT的濃度均極顯著性升高（P＜0.01）；第5天對照組仍極顯著升高（P＜0.05），野菊花組與空白組比較無顯著差異（P＞0.05），與對照組比較顯著降低（P＜0.05）；第7天后，各組差異均不顯著。

表1 雛雞血清中ACTH的含量 （pg/mL）

表2 雛雞血清中CORT的含量 （pg/mL）

2.2 免疫應激對下丘腦CRH mRNA表達水平的影響 由下丘腦CRH mRNA表達水平（見表3）可知，免疫應激后第5天，對照組和野菊花組下丘腦中CRH mRNA的表達量與空白組比較有極顯著的提高（P＜0.01）；野菊花組與對照組比較有極顯著的降低（P＜0.01）。說明，野菊花對降低免疫應激雞下丘腦中CRH mRNA的表達有顯著的作用。

表3 雛雞接種NDⅠ系疫苗后5 d下丘腦CRHm RNA的表達水平

3 討論

應激的作用機制主要是由糖皮質激素介導的，當動物處于免疫應激狀態時，激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic Pituitary Adrenal axis，HPA），下丘腦合成和分泌促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin Releasing Hormone，CRH）增強，激活垂體前葉合成釋放促腎上腺皮質激素（Adre?nocorticotropic Hormone，ACTH），ACTH刺激促腎上腺皮質系統分泌糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）[5]，家禽的為皮質酮（Corticosterone，CORT）[6]。CRH是調節應激最主要的成分之一[7]。免疫應激是相對于正常狀態而言的[8]，可以用下丘腦CRH mRNA表達水平的變化和血清中ACTH、CORT含量的變化可以作為家禽衡量應激狀態的重要指標。本次試驗發現，10頭份/只NDⅠ系疫苗免疫30日齡雛雞，第5天時對照組CRH mRNA的表達水平極顯著升高；1～5 d時對照組CORT和ACTH都顯著高于空白組，證明高劑量注射NDⅠ系疫苗激活HPA軸，建立了雛雞免疫應激模型。

關于緩解免疫應激研究國內外都有報道。在肉仔雞飼料中添加0.2%甘露寡糖或0.2%腐殖酸鹽均能顯著調節免疫功能[12]。藍光可一定程度抑制LPS刺激肉雞引起的日增重減緩和IL-1及應激激素水平升高，并可提高肉雞的免疫功能，對免疫應激具有緩解作用[13]。本研究發現，免疫應激后1～3 d，野菊花組的CRH mRNA和血清中CORT和ACTH的表達有比對照組低的趨勢。第5天時，野菊花組顯著低于對照組，與空白組比較無差異。第7天后各組都無顯著差異。說明免疫1～5 d時，野菊花對免疫應激有緩解作用。因為健康雞群有較強的調節能力，7 d后恢復正常。

野菊花在禽的治療應用報道為1～5 g/只[14]，給藥范圍較大，本研究主要探討野菊花對緩解免疫應激是否有作用，選擇了一種給藥濃度可以確定是否有效，要想確定最佳給藥量，還要開展后續研究。

[1]Virden W S，Lilburn M S，Thaxton JP，et al.The effect of corti?costerone-induced stress on amino acid digestibility in Ross broil?ers[J].Poultry science，2007，86（2）：338-342.

[2]Piquer F J，Sell J L，Sotosalanova M F，et al.Effects of early im?mune stress and changes in dietary metabolizable energy on the development of newly hatched turkeys.1.Growth and nutrient uti?lization[J].PoultSci，1995，74（6）：983-997.

[3]袁志航，文利新，袁慧，等.抗應激劑研究進展[J].動物醫學進展，2008，29（增）：22-23.

[4]王志東，梁容瑞，李宗芳.中藥野菊花的藥理作用研究進展[J].醫學綜述，2009，15（6）：906-909.

[5]Dohms J E，Metz A.Stress-mechanisms of immunosuppression [J].Veterinary immunol-ogy and immunopathology，1991，30（1）：89-109.

[6]Klasing K C，Laurin D E，Peng R K，etal.Immunologicallymedi?ated growth depression in chicks：influence of feed intake，corti?costerone and interleukin-1[J].Journal of nutrition，1987，117（9）：1629-1637.

[7]Tsigos C，Chrousos G P.Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress[J].Journal of psychosomatic re?search，2002，53（4）：865-871.

[8]李建濤，蔡輝益，劉國華.脂多糖刺激對肉仔雞內分泌激素和免疫機能的影響[J].畜牧獸醫學報，2006，37（2）：134-140.

[9]Yang Y，Kocher A，Thomson E，et al.Effects ofmannanoligosac?charide in broiler chicken diets on growth perform-ance，energy utilisation，nutrient digestibility and intestinal microflora[J].Br Poult Sci，2008，49（2）：186-194.

[10]Spurlock M E.Regulation of metabolism and growth during im?mune challenge：an overview of cytokine function[J].Journal of Animal Science，1997，75（7）：1773-1783.

[11]Takahashi K T，Mashiko，Akiba Y.Effect of dietary concentration of xylitol on growth in male broiler chicks during immunological stress[J].Poultry Science，2000，79（5）：743-747.

[12]Tohid T G，Hasan，A lireza T.Efficacy ofmannanoligosaccharides and humate on imm-une response to Avian Influenza（H9）dis?ease vaccination in broiler chickens[J].Veterinary research com?munications，2010，34（8）：709-717.

[13]謝電.藍光對肉雞免疫應激的緩解作用[J].中國獸醫學報，2008，28（3）：325-327.

[14]劉鐘杰，許劍琴.中獸醫學[M].北京：中國農業出版社，2005：164.

The effect of chrysanthemum indicum extract on expression of hypothalam ic CRH m RNA and serum levels of ACTH and CORT in immune stress broilers

YUWen-hui1，JIANG Long1，SU Jing2，ZOU Jia-yu1，LIZi-jia1，JIANG Xiao-wen1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Animal disease control center in heilongjiang province，Harbin 150030，China）

The study was performed to investigate the effect of chrysanthemum indicum extract on levels of ACTH and CORT in serum and expression of hypothalam ic CRH mRNA in immune stress broiler chicks.Testwas divided into blank group，control group and wild chrysanthemum group.Each group contained 80 chickens.Chrysanthemum indicum group drank Chinesemedicine decoction two times each day for 7 days.Control and Chrysanthemum indicum groupswere vaccinated with 10 Newcastle disease vaccine by inteamuscular injection at age of 32-day-old，and blank group injected with saline.Eight chickens from each group were random ly selected to collect blood samples and took hypothalamus at day 1，3，5，7，14，and 21 post immunization.The con?tentof ACTH and CORT weremeasured by the double antibody sand-wich enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.The ex?pression of CRH mRNA wasmeasured by real-time quantitative PCR.The results showed that the content of ACTH and CORT in serum and the expression of CRHmRNA after immunological stresswere significantly increased.And Chrysanthemum indicum sig?nificantly inhibited ACTH and CORT in serum and the expression of CRHmRNA k in hypothalamus.

chrysanthemum indicum；immunological stress；broilers；hormones；mRNA

JIANG Xiao-wen

S831

A

0529-6005（2015）11-0042-03

2014-10-22

于文會（1970-），男，教授，博士，研究方向為中獸藥，E-mail：yuwh6@aliyun.com

姜曉文，E-mail：jiangxiaowen@neau.edu.cn