新疆革蜱源性牛無漿體的PCR檢測

孟 元，張玉婷，吳 敏，郭慶勇，張 楊，巴音查汗

（1.浙江大學生命科學學院，浙江 杭州 310058；2.新疆農業大學動醫學院，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆革蜱源性牛無漿體的PCR檢測

孟 元1，張玉婷2，吳 敏1，郭慶勇2，張 楊2，巴音查汗2

（1.浙江大學生命科學學院，浙江 杭州 310058；2.新疆農業大學動醫學院，新疆 烏魯木齊 830052）

為了解新疆部分地區優勢媒介革蜱類傳播牛無漿體的狀況，隨機采集了吐魯番、巴州等牛場和放牧牛身上寄生的革蜱（N=140只），以16S rRNA基因為靶標分別設計了無漿體屬通用引物（EE1/EE2）和牛無漿體特異性引物（AB1f/AB1r），運用嵌套式PCR方法擴增其全基因組DNA。試驗結果顯示，在140只革蜱全基因組DNA中，擴增出陽性條帶的13只，其牛無漿體的陽性率為9.3%（13/140），這結果被陽性革蜱同一個群的革蜱動物傳播試驗所驗證。經陽性病原DNA的克隆測序、比對后，發現該牛無漿體病原DNA序列與數據庫中的西藏株（AF414399）和福建株（DQ324547）相似，其同源性均為99%。試驗表明，新疆牛無漿體可能被當地的優勢媒介革蜱所攜帶和傳播，該參數可為地方蜱傳無漿體病的綜合防治提供科學依據。

革蜱源性；牛無漿體；PCR；檢測

無漿體病（Anaplasmosis）也稱邊蟲病，是由無漿體（Anaplasma）經蜱傳播而引起牛、羊、鹿等家畜的一種傳染性血液原蟲病[1-3]。1910年在北非首次發現了由邊緣無漿體（Anaplasma marginale）引起牛無漿體病，后來發現該病廣泛分布于世界各地[4]。該病引起宿主動物體重下降，流產，產奶量下降，嚴重者可以致死，牛死亡率可達80%，造成嚴重的經濟損失[5]。據報道，牛無漿體病是蜱傳播中嚴重阻礙養牛業發展的、分布最廣的一種[6]，鑒于此，世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須通報的疫病[7]。在新疆境內分布的媒介蜱蟲種類多、分布廣，草地資源豐富，宿主動物-牛幾乎放牧為主，故宿主牛很容易遭受被媒介蜱的侵襲，發生蜱傳牛無漿體病。目前，對于無漿體病的診斷，可以根據流行病學和臨床癥狀來做出初步判斷，然后通過姬姆薩染色血涂片法發現無漿體來進行確診。但血涂片染色法在感染率很低或在感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結果的準確性，因此，需要分子生物學的方法來快速、準確的診斷無漿體病。本研究運用嵌套式PCR方法檢測

革蜱唾液腺內攜帶的牛無漿體病原，為新疆草原牛無漿體病的流行病學調查和綜合防治提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Premix Ex Taq、DNAMarker 2 000、pMD18-T載體，均購自TaKaRa公司；全血基因組提取試劑盒，購自上海賽百盛基因技術有限公司；膠回收試劑盒，購自Axygen公司；DH5α，購自北京全式金生物技術有限公司。DNA C1000 Thermal Cycler PCR擴增儀Bio-Rad公司產品，DYY-Ⅱ型電泳儀為北京六一儀器廠產品，JS-680全自動凝膠成像分析儀為上海培清科技有限公司產品。

1.2 擴增引物 第1輪擴增引物EE1/EE2[8]可擴增無漿體16S rRNA基因，具有屬特異性，預擴增的目的片段為1 430 bp，上游引物EE1：5′-TCCT?GGCTCAGAACGAACGCTGGC-3′，下游引物EE2：5′-AGTCACTGACCCAACCTTAAATGGCTG-3′；第2輪擴增引物AB1f/AB1r[9]可以特異性擴增牛無漿體16S rRNA基因，預擴增的目的片段長度為551 bp，序列如下：上游引物AB1f：5′-CTCGTAGCTT?GCTATGAGAAC-3′，下游引物AB1r：5′-TCTCCCG?GACTCCAGTCTG-3′。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.3 蜱蟲攜帶無漿體基因組DNA的提取 蜱蟲樣品有新疆農業大學合作項目團隊采集于吐魯番、巴州等地養殖牛場和放牧牛體表，經鑒定到革蜱屬（N=140只，包括銀盾革蜱和草原革蜱，鑒定結果省略）后，按規定運輸送來浙大生科院實驗室待檢。將單個蜱蟲樣品置于大平皿中用蒸餾水刷洗干凈后，在研缽中研磨充分后，加入200μL PBS（1×）緩沖液，20μL Proteinase K消化液，混勻，與56℃恒溫水浴鍋消化30min后，用DNA提取試劑盒進行革蜱DNA，DNA分裝后-20℃保存備用。

1.4 蜱源性牛無漿體的PCR檢測 根據Liu等[10]使用的PCR的方法對上述蜱蟲樣品進行檢測。巢式PCR的第一輪反應體系為20μL：Premix Ex Taq 10 μL，EE1（10μmol/L）2.0μL，EE2（10μmol/L）2.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O 4.0μL。反應條件為94℃3min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，35個循環；72℃10min。將第1輪擴增產物作為第2輪反應的模板，PCR反應體系為20μL：Premix Ex Taq10μL，AB1f（10μmol/L）2.0μL，AB1r（10μmol/L）2.0μL，第1輪擴增產物1.0μL，ddH2O 5.0μL。反應條件為94℃3min；94℃30 s，55℃30 s，72℃40 s，35個循環；72℃5min。擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據電泳后PCR產物的位置確定是否為所擴增的目的片段。

1.5 PCR產物的連接、克隆及測序鑒定 為鑒定該檢測方法的準確性，隨機選取PCR陽性產物，利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化的條帶，然后進行連接。連接反應體系為10μL，包括：純化的產物4μL，SolutionⅠ5μL，pMD18-TVector 1μL，充分混勻后16℃水浴連接過夜。取連接產物轉化到E.coli DH5-α細胞中，經菌液PCR鑒定后送英駿（上海）貿易有限公司進行測序。

1.6 16S rRNA基因序列同源性分析 將獲得的序列提交至NCBI數據庫，使用Genetyx（version7）和BLAST在線服務分析基因的同源性分析。從NCBI網站GenBank數據庫中下載相關物種的16S rRNA基因序列。

2 試驗結果

2.1 蜱蟲基因組的提取 將提取的蜱蟲DNA 5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，均得到清晰的電泳條帶，由此驗證蜱DNA提取成功。

2.2 蜱源性牛無漿體PCR檢測結果 以提取的蜱蟲基因組DNA為模板，采用巢式PCR方法進行檢測，第1輪EE1/EE2擴增結果在1 500 bp附近有特異性的陽性條帶（見圖1），第2輪AB1f/AB1r擴增結果在500 bp附近有特異性的陽性條帶（見圖2），與預測的目的的片段大小一致。試驗表明，新疆吐魯番和巴州部分地區分布的革蜱類攜帶牛無漿體，其感染率為9.3%（13/140）。該結果被同一類革蜱的動物傳播試驗驗證（該文省略此結果）。

圖1 無漿體屬通用引物EE1/EE2PCR檢測M：DNA分子質量標準；1～2：吐魯番樣品的疑似樣品PCR產物；3：陰性對照

圖2 牛無漿體特異性引物AB1f/AB1rPCR檢測M：DNA分子質量標準；1～7：吐魯番部分樣品的PCR產物；8：陰性對照

表1 不同地區牛體表革蜱攜帶牛無漿體的感染率

2.3 16S rRNA基因的克隆、測序 在巢式PCR所檢測出的13份陽性樣品進行16S rRNA基因的克隆和測序，將PCR鑒定為陽性的菌液送往英駿（上海）貿易有限公司進行測序，使用NCBI網站的BLAST將測序序列與核酸數據庫中的序列進行比對，結果顯示，與西藏[11]株（基因登錄號：AF414399）和福建株（基因登錄號：DQ324547）的無漿體相比，同源性均為99%。通過牛無漿體特異性引物檢測，結果顯示也為陽性，即采自吐魯番等地的部分革蜱攜帶牛無漿體病原，表明該巢式PCR的檢測結果準確可靠。

3 討論與小結

牛無漿體主要感染動物的單核細胞，可通過長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和巨刺血蜱（H. megaspinosa）進行傳播[12-14]。我國對于牛無漿體的流行病學資料稀少，目前僅有周作勇等[15]從分子水平上證實了重慶市存在牛無漿體及上海獸醫研究所Liu等[10]對浙江、湖北、河南、貴州四省山羊中無漿體的流行狀況進行了調查，遲慶安[7]運用分子生物學的方法對四川、重慶、云南、貴州、廣西、湖南、廣東等南方地區牛無漿體病的流行情況進行了調查。有關新疆牛無漿體病的流行病學資料幾乎空白，為彌補我國西域區域牛無漿體流行病學資料，筆者結合浙大-新疆農大合作項目，對新疆吐魯番、巴州等地區的蜱源性牛無漿體病原進行了檢測。結合之前的有關蜱傳病研究表明，牛無漿體常常與牛梨形蟲（俗稱牛焦蟲）混合感染，在我國新疆部分地區廣泛流行，應引起相關部門的高度重視。

本試驗結果表明，采自新疆吐魯番的部分革蜱（包括銀盾革蜱和草原革蜱）攜帶牛無漿體，其陽性率達2.8%，而巴州地區的部分革蜱攜帶牛無漿體的陽性率可達34.4%。這可能由于巴州牧業縣的牛群自然放牧為主，與革蜱接觸頻繁有關，導致牛無漿體的感染率偏高，建議加強防范。有關地方媒介蜱攜帶病原種類及其生物學特性與宿主動物關系等待進一步研究，這次試驗研究為當地的蜱傳疾病的綜合防治奠定基礎。

[1]蔣金書.動物原蟲學[M].北京:中國農業大學出版社，2000：116-119.

[2]黨志勝，蔣錫仕，黃孝紛.我國牛羊邊蟲及邊蟲病的研究現狀[J].青海畜牧獸醫雜志，2003，4（33）：39-41.

[3]吳鑒三.牛邊緣無漿體病的研究進展[J].動物檢疫，1992，2（9）：23-25.

[4]Aubry P，Geale DW.A review of bovine anaplasmosis[J].Trans?bound Emerg Dis，2011，58（1）：1-30.

[5]Kocan KM，Blouin E F，Barbet A F.Anaplasmosis control：Past，present，and future[J].Ann N Y Acad Sci，2000，916：501-509.

[6]徐梅倩，陳克喜，張北民.斑點免疫金滲慮法檢測邊蟲病的研究[J].中國獸醫寄生蟲病，1996，4（3）：102-111.

[7]Reinbold J B，Coetzee J F，Sirigreddy K R，et al.Detection of Anaplasmamarginale and A.phagocytophilum in bovine peripher?al blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay[J].JClin Microbiol，2010，48（7）：2424-2432.

[8]Barlough JE，Madigan JE，Derock E，et al.Nested polymerase chain reaction for detection of Ehrlichia equi genomic DNA in horses and ticks（Ixodes pacificus）[J].Vet Parasitol，1996，63（3-4）：319-329.

[9]Kawaha M，Rikihisa Y，LIN Q，et al.Novel genetic variants of Anaplasma phagocytophilum，Anaplasma bovis，Anaplasma central，and a novel Ehrlichia sp.In wild deer and ticks on twomajor islands in Japan[J].Appl Environ Microbiol，2006，72（2）：1102-1109.

[10]Liu Z，Ma M，Wang Z，etal.Molecular survey and genetic identi?fication of Anaplasma species in goats from central and southern China[J].Appl Environ Microbiol，2012，78（2）：464-470.

[11]BohaiWen，Rui Jian，Youzhi Zhang，et al.Simultaneous Detec?tion of Anaplasma marginale and a New Ehrlichia Species Closely Related to Ehrlichia chaffeensis by Sequence Analyses of 16SRi?bosomal DNA in Boophilusmicroplus Ticks from Tibet[J].Journal of Clinical Microbiology，Sept.2002，p.3286-3290.

[12]Yoshimotok，Mat suyama Y，Mat Sudah，et al.Detection of Ana?plasma bovis and Anaplasma phagocytophilum DNA from Haema?physalismegaspinosa in Hokkaido，Japan[J].Vet Parasitol，2010，168（1-2）：17-172.

[13]Leem J，Chae J S.Molecular detection of Ehrlichiach affeensis and Anaplasma bovis in the salivary glands from ticks[J].Vector Borne Zoonotic Dis.2010，10（4）：411-413.

[14]Kim C M，Kim M S，Park M S，et al.Identification of Ehrlichia chaffeensis，and A.bovis in Haemaphysalis longicornis and Ixo?des persulcatus ticks from Korea[J].Vector Borne Zoonotic Dis，2003，3（1）：17-26.

[15]周作勇，聶奎，唐成，等.牛無漿體16S rRNA基因的克隆測序及分析[J].畜牧獸醫學報，2010，41（10）：1359-1363.

PCR Detection of Dermacentor-borne Anaplasma bovis in Xinjiang

MENG Yuan1，ZHANG Yu-ting2，WUMin1，GUOQing-yong2，ZHANG Yang2，Bayinchahan2
（1.College of life Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.College of VeterinaryMedicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

In order to investigate whether Anaplasma bovis was spread mainly by Dermacentor in parts of Xinjiang，one hun?dred and forty ticks from cattleswere collected in Turpan，Bazhou，and other epidem ic areas.The universal primers（EE1/EE2）and gene specific primers（AB1f/AB1r）were designed to target the 16S rRNA of Anaplasma bovis and nested PCR was applied to am?plify its full genomic DNA.The results showed that 13 positive bandswere observed in 140 genome DNA samples from Dermacen?tor，and the positive rate of Anaplasma bovis was 9.3%（13/140），which were verified by Dermacentor spread pathogenic on animals of experiments from the same group of positive Dermacentor.DNA-positive pathogens were cloned and sequenced.The results showed that the DNA sequence of Anaplasma bovis was similarwith Tibet strain（AF414399）and Fujian strain（DQ324547）in the database，and their homology were 99%.The study suggestes that Anaplasma bovis is inmainly in Dermacentor and transmissed by Dermacentor in Xinjiang，our data provides the basis for the prevention of tick-borne Anaplasma in Xinjiang.

Dermacentor-borne；Anaplasma bovis；PCR；detection

Bayinchahan

S852.74+6

A

0529-6005（2015）11-0036-03

2015-04-26

新疆維吾爾自治區科技支疆項目（2013911061）

孟元（1991-），女，博士生，從事生物化學與分子生物學研究，E-mail：673177231@qq.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com