不同禽源坦布蘇病毒抗原相關(guān)性的測(cè)定與分析

傅秋玲，傅光華，黃 瑜，程龍飛，萬(wàn)春和，施少華，陳紅梅，陳翠騰，陳 珍，林建生

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

不同禽源坦布蘇病毒抗原相關(guān)性的測(cè)定與分析

傅秋玲，傅光華，黃 瑜，程龍飛，萬(wàn)春和，施少華，陳紅梅，陳翠騰，陳 珍，林建生

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

為了比較不同禽源坦布蘇病毒（TMUV）抗原的相關(guān)性，通過(guò)細(xì)胞微量血清交叉中和試驗(yàn)測(cè)定了分離自種鴨、蛋雞、肉鵝的不同禽源坦布蘇病毒之間的抗原相關(guān)值，并進(jìn)行了抗原相關(guān)性分析。結(jié)果測(cè)得抗鴨源TMUV陽(yáng)性血清對(duì)鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價(jià)分別為1∶1 349、1∶1 202和1∶1 318，抗雞源TMUV陽(yáng)性血清對(duì)鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價(jià)分別為1∶1 023、1∶1 023和1∶977，抗鵝源TMUV陽(yáng)性血清對(duì)鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價(jià)分別為1∶933、1∶912和1∶955。根據(jù)親緣值（R值）（R=√r1×r2）計(jì)算公式，得出鴨源TMUV與雞源TMUV、鵝源TMUV間的抗原親緣值（R）分別為0.94和0.95，雞源TMUV與鵝源TMUV間的抗原親緣值（R）為0.91，可見(jiàn)3種不同禽源TMUV之間的R均大于0.7，表明三者為同一血清型的坦布蘇病毒。

坦布蘇病毒；不同禽源；抗原相關(guān)性；測(cè)定

2010年的4月以來(lái)，我國(guó)南方大部分地區(qū)種（蛋）鴨相繼發(fā)生了一種以產(chǎn)蛋驟降為主要特征的傳染病。研究者對(duì)該病從病毒分離、形態(tài)學(xué)觀察、理化特性測(cè)定、全基因組測(cè)序與分析和動(dòng)物致病性試驗(yàn)等方面開(kāi)展了一系列研究，最終明確了其病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）[1-5]。這幾年相繼又有種（蛋）雞、鵝、白羽半番鴨、櫻桃谷鴨、麻雀和鴿子感染TMUV的病例報(bào)道，表明該病毒的感染宿主在不斷增多，感染譜在不斷拓寬，已嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[6-12]。

目前關(guān)于TMUV生物學(xué)特性、抗原性、主要毒

力和結(jié)構(gòu)蛋白功能等相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，開(kāi)展對(duì)該病毒的抗原性研究不僅可揭示不同禽源TMUV的抗原相關(guān)性，還可促進(jìn)疫苗研發(fā)工作進(jìn)程，為禽類防治該病提供依據(jù)。

基于國(guó)內(nèi)已報(bào)道鴨源、雞源和鵝源TMUV基因組之間的核酸序列和氨基酸序列的同源性均很高，分別達(dá)98.4%和98.6%以上[13]。鑒于此，這3種不同禽源TMUV的抗原相關(guān)性如何？本研究通過(guò)細(xì)胞微量交叉中和試驗(yàn)明確其抗原相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗(yàn)鴨胚 WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定和保存，10日齡鴨胚（無(wú)TMUV母源抗體），購(gòu)自華南生物農(nóng)大生物藥品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 陽(yáng)性血清抗體、陰性血清抗體的制備 陽(yáng)性血清抗體是濃縮的滅活WR株鴨源TMUV、FQC1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液分別經(jīng)甲醛滅活后與弗氏不完全佐劑按1∶1比例進(jìn)行乳化，首次免疫成年鴨、雞和鵝，間隔2周后，與弗氏完全佐劑乳化后再次免疫，3免后采集血液制備血清，應(yīng)用鴨胚成纖維細(xì)胞中和試驗(yàn)法測(cè)定抗血清效價(jià)，56℃滅活后分裝凍存?zhèn)溆谩ｊ幮匝蹇贵w的制備是采集自無(wú)TMUV母源抗體鴨胚孵化而得的雛鴨，56℃滅活后分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原代鴨胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下取出12日齡鴨胚的胚體，置于平皿內(nèi)，用小鑷子去內(nèi)臟、頭、翅膀和腿等器官后將剩余的胴體放入50 mL的燒杯。用DMEM培養(yǎng)基漂洗3次，將剪刀剪成1 mm3左右的小塊，再用DMEM培養(yǎng)基漂洗3次后，棄去上清。將燒杯內(nèi)的小組織塊移入錐形瓶?jī)?nèi)，加入適量的胰酶后置入37℃水浴鍋內(nèi)，消化約10min至組織小塊邊緣出現(xiàn)毛絨狀為止。棄去胰酶，加入DMEM培養(yǎng)基漂洗3次，棄去上清。加入適量培養(yǎng)基吹打組織小塊至呈單個(gè)細(xì)胞后，將液體加入8層紗布過(guò)濾。加入完全培養(yǎng)基（含6%胎牛血清）稀釋至25mL后，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后將細(xì)胞密度調(diào)整至106個(gè)/m L，加入96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.2.3 不同禽源TMUV細(xì)胞適應(yīng)毒的復(fù)壯 將不同禽源TMUV鴨胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)毒接種于鴨胚成纖維細(xì)胞上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至出現(xiàn)75%的細(xì)胞病變后置-80℃冰箱凍存，反復(fù)凍融3次后收毒，病毒液分裝后標(biāo)明批次，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 不同禽源TMUV TCID50的測(cè)定[14]分別對(duì)WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液用不完全培養(yǎng)基DMEM進(jìn)行10倍系列稀釋，將10-1-10-10每稀釋度按0.1mL/孔的劑量接種于使用96孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)的原代鴨胚成纖維細(xì)胞中，37℃孵育1 h，棄去病毒液，以PBS洗滌1次后按200μL/孔加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)1周并觀察記錄細(xì)胞病變結(jié)果，按K?rber法計(jì)算TCID50。

1.2.5 細(xì)胞微量血清中和試驗(yàn)的操作程序 采用固定病毒稀釋血清法[15]。首先制備原代鴨胚成纖維細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，次日將處理好的血清以滅菌PBS（pH值=7.2）進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋。以稀釋好的血清與病毒于37℃進(jìn)行感作處理1 h。將感作后的病毒-血清混合液以100μL/孔的量加入已含單層細(xì)胞的96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)血清梯度接種5個(gè)孔。同時(shí)，設(shè)病毒對(duì)照、血清對(duì)照和細(xì)胞空白對(duì)照孔，均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每天觀察兩次細(xì)胞病變，記錄試驗(yàn)結(jié)果。以病毒對(duì)照全部死亡及血清、PBS對(duì)照全部存活為試驗(yàn)成立。按K?rber方法計(jì)算血清抗體效價(jià)。

1.2.6 細(xì)胞微量血清交叉中和試驗(yàn) 首先將3種禽源TMUV陽(yáng)性血清用滅菌PBS作倍比稀釋。且將含200TCID50/0.2 mL的病毒（WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液）分別與不同稀釋度的陽(yáng)性血清等量混合，于37℃孵育1 h。其他步驟按照1.2.5進(jìn)行操作。

1.2.7 判定標(biāo)準(zhǔn) 參照口蹄疫病毒血清型和亞型的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[15]，由異源血清與同源血清效價(jià)之比得到2個(gè)比值（r1和r2），再根據(jù)公式親緣值（R值）：R=√r1×r2計(jì)算得出。

2 結(jié)果

2.1 不同禽源TMUV TCID50的測(cè)定按K?rber方法計(jì)算出WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV的TCID50值分別為105.96/0.1 mL、105.69/0.1mL、105.62/0.1mL。

2.2 細(xì)胞微量交叉中和效價(jià)及R值 采用固定病毒（200TCID50/0.2mL）稀釋血清法對(duì)鴨源、鵝源和雞源TMUV進(jìn)行細(xì)胞微量交叉中和試驗(yàn)。利用交叉中和抗體效價(jià)按公式計(jì)算兩種間的親緣值（R值）（表2），結(jié)果顯示，WR株鴨源TMUV與FQC1株雞源TMUV、WR株鴨源TMUV與GD06株鵝源TMUV和FQ-C1株雞源TMUV與GD06株鵝源TMUV的R值分別為0.94、0.95和0.91。因此，不同禽源TMUV的R值都大于0.7，表明3種不同禽源TMUV處于同一種血清型。

表1 不同禽源TMUV與相應(yīng)血清交叉中和試驗(yàn)

表2 不同禽源TMUV毒株間R值

3 討論與結(jié)論

坦布蘇病毒是黃病毒（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）的坦布蘇病毒成員，其基因組全長(zhǎng)約為10 278 nt，編碼3 425個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，由3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、膜前體蛋白M和包膜蛋白E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）組成[16]。自2010年以來(lái)，我國(guó)研究發(fā)現(xiàn)不同禽源的坦布蘇病毒全基因組核苷酸的同源性很高[16]。本研究選用的FQ-C1株雞源TMUV與2010年后分離的TMUV全基因組核苷酸的同源性均達(dá)98%以上，與WR株鴨源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性都達(dá)99.2%，與鵝源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性亦達(dá)99%和98%以上[12]；WR株鴨源TMUV與鵝源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性也為99%以上[17]，且GenBank中近幾年公布TMUV各分離株間的序列無(wú)宿主來(lái)源或分離地點(diǎn)的特性差異[12]。

本研究利用細(xì)胞微量血清交叉中和試驗(yàn)測(cè)定了不同禽源的抗原相關(guān)值，結(jié)果顯示，3株不同禽源TMUV之間的R值都達(dá)0.9以上，均大于0.7，表明這3種不同禽源的TMUV不存在抗原性差異，為同一血清型坦布蘇病毒，與基因組核苷酸同源性高的結(jié)果相一致。

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Identification and analysis of the antigenicity of Tembusu virus from different avian

FUQiu-ling，F(xiàn)UGuang-hua，HUANG Yu，CHENG Long-fei，WAN Chun-he，SHIShao-hua，CHEN Hong-mei，CHEN Cui-teng，CHEN Zhen，LIN Jian-sheng
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science，F(xiàn)uzhou 350013，China）

In order to study the antigenicity of different avian Tembusu viruses isolated from breeding duck，laying hen，and meat goose，serum cross cellmicro-neutralization testwas employed to analyze the antigenicity of the viruses.The results of serum cross neutralization test showed that the neutralization titers of reaction between sera against TMUV from ducks and different avian Tembusu viruseswere 1∶1349，1∶1202 and 1∶1318，respectively.The neutralization titers of reaction between sera against TMUV from chickens and differentavian Tembusu viruseswere 1∶1023，1∶1023 and 1∶977，respectively.The neutralization titers of reac?tion between seras against TMUV from geese and different avian Tembusu viruseswere 1∶933，1∶912 and 1∶955，respectively.Ac?cording to the relative value（R value）calculation formula（R=√r1×r2），the R value between TMUV from ducks and TMUV from chickens or TMUV from geese were 0.94 and 0.95，and the R value between TMUV from chickens and TMUV from geese was 0.91，which was more than 0.7.The results indicate that the three different avian Tembusu viruses belong to the same sero-sub?type，and the crossprotectionsexistamong them.

Tembusu virus；differentavian；antigenicity；identification

HUANG Yu

S852.65

A

0529-6005（2015）11-0030-03

2015-06-11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS -43）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201936）；福建省優(yōu)良蛋鴨品種與設(shè)施化養(yǎng)殖創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)化工程項(xiàng)目；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研項(xiàng)目（2013DQB-3）；福建省農(nóng)科院“雙百”行動(dòng)項(xiàng)目（sbmx1507-3）

傅秋玲（1985-），女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)免疫，E-mail：qiulingfu0822@163.com

黃瑜，E-mail：huangyu_815@163.com