氯離子敏感的YFP-H 148Q/V163S在FRT細胞中的表達及其應用研究

鄭 鍇，張雲喬，許會靜，方 芳，楊紫嫣，鄭 巖，董校汝，李榮霞，郝 峰

（吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013）

氯離子敏感的YFP-H 148Q/V163S在FRT細胞中的表達及其應用研究

鄭 鍇，張雲喬，許會靜，方 芳，楊紫嫣，鄭 巖，董校汝，李榮霞，郝 峰

（吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013）

運用點突變試劑盒構建pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表達載體，脂質體介導YFP-H148Q/V163S轉染穩定表達Ano1的FRT細胞，熒光淬滅動力學試驗檢測YFP-H148Q/V163S對其氯離子的敏感性。測序結果顯示，YFP（yellow fluorescent protein）特異編碼序列上第508-510位堿基CAC突變為CAG，148位組氨酸H突變為谷氨酰胺Q；第553-555位堿基GTG突變為AGC，163位纈氨酸V突變為絲氨酸S。熒光淬滅動力學試驗結果顯示，向表達YFP-H148Q/V163S的FRT細胞加入Ano1激活劑ionomycin和Cl-，其相對熒光強度明顯下降。pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163真核表達載體成功構建，并證實表達于FRT胞漿中的YFP-H 148Q/V163S具有對氯離子敏感的特性。

YFP-H148Q/V163S；FRT；相對熒光強度

氯離子是機體內含量最多的陰離子，可通過跨膜轉運改變細胞內外的氯離子濃度來維持細胞外液滲透壓和細胞正常功能。氯離子通道（cal?cium-activated chloride channels，CaCCs）是一類廣泛表達機體多種細胞膜上可通透Cl-的陰離子通道，是多種疾病診斷的生物標志物和治療的潛在藥物靶點[1]。傳統檢測細胞內氯離子的方法常用氯離子敏感的熒光染料，但易出現熒光漂白現象，重復操作易污染細胞[2]。近年來從水母提取出來的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為新型的分子標記物備受青睞，具有通用性好、細胞毒性低、在活細胞內可長久表達、并且相對熒光信號不易發生淬滅等特性[3-4]，此外在一系列基于GFP的生物傳感器已經成為檢測活細胞內離子活動的一個重要工具[5]。相關文獻報道對黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）進行一系列點突變，改變其氨基酸組成可提高其對氯離子親和力[6]，因

此本實驗構建黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）突變體的真核表達載體pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163，研究YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性，對細胞內外氯離子的測定和檢測氯離子通道開放情況等相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 pRSETB-YFP和pcDNA3.1由大連醫科大學麻彤輝教授饋贈；QuickchangeTM點突變試劑盒，購自Stratagene公司；穩定表達pEGFPAno1的FRT細胞由本實驗室前期制備；Lipofectamine LTX，購自Invitrogen公司；NMDG-Cl、MgCl2、MnCl2、CdCl2、GdCl3、glucose、HEPES和70d-mannitol，購自BBI公司；Ionomycin和T16Ainh-A01，購自Sigma公司；倒置熒光顯微鏡，購自Nikon公司；FluoStar Optima多功能酶標儀，購自德國BMG LABTECH；引物和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 YFP-pcDNA3.1質粒的構建和鑒定 以pR?SETB-YFP為模板，PCR擴增YFP基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，BamH I和Not I雙酶切目的片段和pcDNA3.1載體，酶切產物切膠回收后T4連接酶進行連接反應。將pcDNA3.1-YFP質粒轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，提取質粒并測定濃度，酶切鑒定正確后回收陽性片段，并送測序公司鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163質粒的構建和鑒定 根據YFP特異編碼序列，分別設計第148位和163位氨基酸定點突變引物a和b，見表1。

表1 YFP-H148Q/V163S雙突變體的引物設計

以pcDNA3.1-YFP為模板，利用引物a參照點突變試劑盒說明書構建YFP-H148Q突變體。限制性內切酶DpnI純化突變產物后轉化E.coli XL1-Blue感受態細胞，其轉化、質粒提取、酶切和測序步驟與上述大致相同。以pcDNA3.1-YFP-H148Q為模板，用引物b突變合成pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S，步驟與YFP-H148Q突變步驟一致。

1.2.3 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163質粒轉染FRT細胞 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質粒和脂質體Lipofectamine LTX以0.5μg：2.5μL配比稀釋后充分混勻，轉染穩定表達Ano1的FRT細胞，48 h后觀察YFP-H148Q/V163S在FRT細胞中的表達情況。

1.2.4 熒光淬滅動力學試驗 選取轉染效率高的FRT細胞，用PBS反復洗滌細胞3次，每次200 μL，最后一次留50μL PBS。利用FluoStar Optima多功能酶標儀，以5 s/點的速度連續測定14 s，記錄下胞漿相對熒光強度隨時間變化的動態曲線。前2 s為基線，2 s后以170μL/s的速度向96孔板中每孔注入200μmol/L ionomycin和120μL的高Cl-溶液，繼續測定12 s。不加ionomycin的高Cl-溶液和加Ano1抑制劑T16Ainh-A01的高Cl-溶液作為陰性對照。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質粒酶切和測序結果 pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163S質粒經BamH I和Not I雙酶切產生2條清晰條帶，大小分別與pcDNA3.1載體片段（5 597 bp）和YFP片段（729 bp）相符（見圖1）。測序結果經NCBI與YFP序列Blast顯示YFP突變位置，YFP序列第508-510位堿基CAC突變為CAG，組氨酸H突變為谷氨酰胺Q；第553-555位堿基GTG突變為AGC，纈氨酸V突變為絲氨酸S（見圖2）。酶切與測序結果表明，成功構建YFPH148Q/V163S真核表達載體。

圖1 YFP-H148Q/V163S酶切1：BamH I單酶切；2：Not I單酶切；3：BamH I/Not I雙酶切；4：YFP-H148Q/V163S；M：Trans2K Plus DNAMarker

圖2 YFP突變位置示意

2.2 轉染前后FRT細胞形態特點 轉染前期已將Ano1穩定轉染FRT細胞中，倒置熒光顯微鏡觀察到細胞膜上發出綠色熒光，證實FRT細胞已穩定表達Ano1。見中插彩版圖3A和B。轉染YFP-H148Q/ V163S后胞漿可見到黃色熒光，證實YFP-H148Q/ V163S在FRT胞漿內表達。見中插彩版圖3C。

2.3 熒光淬滅動力學試驗結果 轉染后FRT細胞中加入含ionomycin的高Cl-溶液，結果表明，FRT胞漿中相對熒光強度顯著下降（見圖4A）。不加ionomycin的高Cl-溶液和加Ano1抑制劑T16Ainh-A01的高Cl-溶液注入后相對熒光強度均不變，（見圖4B）。結果證實，YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性。

3 討論

圖4 熒光淬滅動力學試驗A：加入ionomycin后熒光淬滅動力學試驗結果；B：未加ionomycin和加入T16Ainh-Aol后熒光淬滅動力學試驗結果

正常生理條件下哺乳動物細胞內氯離子濃度＜40mmol/L且相對比較穩定[7]，YFP對細胞內氯離子濃度變化敏感程度不高。相關研究表明，YFP序列上的氨基酸單突變體可提高YFP對氯離子的親和力，生物信息學和后續研究表明YFP相應的雙突變體具有更強的氯離子敏感性。本試驗采用PCR定點突變技術[8]成功將第148位組氨酸H突變為谷氨酰胺Q，第163位纈氨酸V突變為絲氨酸S。Ano1（TMEM16A）是表達在細胞膜上的一種鈣激活氯離子通道[9]，將YFP-H148Q/ V163S轉染入在前期工作我們已經建立了穩定表達Ano1的FRT細胞模型，熒光淬滅動力學實驗證實YFP-H148Q/V163S對Cl-具有敏感性。

氯離子及氯離子通道在多種生理功能和病理過程中發揮重要作用[1-7]，發展敏感、簡便的氯離子濃度測定方法不僅可檢測細胞內外氯離子濃度的動態變化，而且可同時反映氯離子通道的功能狀態，可極大促進該領域的研究。本實驗證實了YFP-H148Q/V163S對氯離子具有敏感性，可用以發展監測活細胞內氯離子動態變化的特異性生物傳感器，為后期純化蛋白研制檢測氯離子濃度試劑盒和開發高通量細胞檢測技術具有重要意義。YFP-H148Q/V163S感受氯離子跨膜轉運引起的胞質中氯離子濃度變化，能夠反映Ano1的開放情況及功能狀態，為后續研究Ano1鈣激活氯離子通道以及其他氯離子通道的開放情況與調節劑的篩選奠定基礎。

[1]Bill A，Hall M L，Borawski J，et al.Smallmolecule-facilitated degradation of ANO1 protein：a new targeting approach for anti?cancer therapeutics[J].JBiol Chem，2014，289（16）：11029-41.

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Expression and app lication of YFP-H148Q/V163Sas chloride ion Sensor in FRT cells

ZHENG Kai，ZHANG Yun-qiao，XU Hui-jing，FANG Fang，YANG Zi-yan，ZHENG Yan，DONG Xiao-ru，LIRong-xia，HAO Feng
（DepartmentofMedicine Laboratory，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

To study the chloride ion sensitivity of YFP-H 148Q/V163S in FRT cells，pcDNA3.1-YFP-H 148Q/V163 was con?structed using the QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit.YFP-H148Q/V163Swas transfected into FRT cells stably express?ing Ano1 by liposome.The chloride ion sensitivity of YFP-H148Q/V163Swas detected by the fluorescence quenching kinetics test. Sequence analysis indicated that CAC at 508-510 bp site of YFP was substituted for CAG，in which the 148-amino acid H was substituted for Q；GTG at553-555 bp sitewas substituted for AGC,in which the 163-amino acid V was substituted for S.The re?sults of fluorescence quenching kinetics test confirmed that the relative fluorescence intensity of YFP-H148Q/V163Swas signifi?cantly decreased upon the addition of ionomycin and extracellular Cl-.pcDNA3.1-YFP-H148Q/V163 was successfully established and YFP-H148Q/V163S in FRT cellswas significantly sensitive to chloride ion.

YFP-H148Q/V163S；FRT；the relative fluorescence intensity

HAO Feng

Q785.786，Q256

A

0529-6005（2015）11-0006-03

2015-03-24

吉林省衛生計生科研計劃（2014Z103）；吉林省教育廳基金資助課題（2013-351）；國家自然科學基金資助項目（812022031）；2013年吉林省大學生創新創業訓練計劃；吉林醫藥學院大學生科研基金資助課題[吉醫學科字（2012）第12號]

鄭鍇（1980-），女，講師，碩士，研究方向為氯離子通道結構和功能的研究，E-mail：carane@163.com

郝峰，E-mail：haof863@126.cn