阿拉善雙峰駝卵泡發育過程中顆粒細胞差異蛋白質組學研究

陶金忠，趙國順，趙興緒，胡俊杰，張 勇

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.天水市動物疫病預防控制中心，甘肅 天水 741600；3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

阿拉善雙峰駝卵泡發育過程中顆粒細胞差異蛋白質組學研究

陶金忠1，趙國順2，趙興緒3，胡俊杰3，張 勇3

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.天水市動物疫病預防控制中心，甘肅 天水 741600；3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

為了比較阿拉善雙峰駱駝卵泡發育過程中顆粒細胞內蛋白質表達的變化，根據卵泡直徑將顆粒細胞分為兩類，利用雙向電泳技術構建阿拉善雙峰駱駝顆粒細胞蛋白質二維凝膠電泳圖譜，凝膠經考馬斯亮藍染色后，以3倍以上的表達變化用PDQuest 8.0軟件比較這兩類顆粒細胞中蛋白質的表達差異。結果共檢測到了12個差異點，經MALDI TOF/TOF-MS/MS鑒定發現它們是12種不同的蛋白質。其中丙酮酸脫氫酶E1、annexin A2可能與顆粒細胞能量代謝有關，這為阿拉善雙峰駱駝顆粒細胞的研究奠定了理論依據。

阿拉善雙峰駱駝；二維電泳；蛋白質組學；顆粒細胞

阿拉善雙峰駝是國家二級保護動物，其生殖特點與大多數哺乳動物不同的是它的排卵方式為誘導排卵[1]。顆粒細胞增殖分化是卵泡發育的重要環節，其是由原始卵泡中的卵泡細胞在卵泡發育的初級卵泡階段形成的，顆粒細胞的分化過程也是卵泡的發育過程。顆粒細胞通過合成多種激素及生長因子，并表達其受體來調控卵母細胞的生長、排卵以及卵泡的啟動、發育和閉鎖[2]。如雌激素受體α、褪黑素等多種蛋白質通過顆粒細胞調節生殖生理機能。蛋白質組學可以讓人們從蛋白質整體水平理解顆粒細胞，目前并沒有關于顆粒細胞蛋白質組學的報道。因此，我們根據卵泡的大小將顆粒細胞分為兩類，用蛋白質組學技術尋找不同大小卵泡中顆粒細胞內蛋白表達的差異，從而為探索雙峰駝卵泡發育過程中顆粒細胞生理機制的研究提供參考依據。

1 方法

1.1 樣品采集與制備 于西寧屠宰場采集宰殺后阿拉善駝的卵巢，共24個，置于加有雙抗的37℃生理鹽水中帶回實驗室。將卵巢用滅菌的生理鹽水

沖洗后，按照卵泡的直徑將其分為兩類（d≤10mm；d＞10mm），然后在無菌條件下用1mL注射器吸取卵泡液，均勻混合。將卵泡液10 000 r/min（4℃）離心5min棄去上清，用100μL的PBS沖洗后10 000 r/min（4℃）離心5min，棄上清，加入100μL的蛋白質裂解液，置于液氮罐中反復冷凍10次，常溫溶解后，渦旋30 s。Bradford法定量。

1.2 雙向電泳 具體步驟參照Bio-Rad蛋白質組學雙向電泳實驗操作手冊。

將樣品與上樣緩沖液混合后，100 00 r/min（4℃）離心10 min。設置等電聚焦程序：50 V，14 h（主動水化）；250 V（線性），1 h；1 000 V（線性），1 h；9 000 V（線性），6 h；9 000 V（線性），80 000 Vh；500 V（快速），任意時間。第一項結束后分別用6mL的膠條平衡緩沖A液和6mL的膠條平衡緩沖B液平衡15 min。然后用12%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，設置電泳程序：50 V，1 h；然后調至200 V，待溴酚藍線距離玻璃板下沿1 cm時停止電泳。

1.3 差異點質譜檢測 經染色后脫色的凝膠用掃描議掃描。再用PDQuest8.0軟件以蛋白表達譜上“斑點染色強度和面積三倍量的變化”為標準進行差異分析，檢測差異蛋白點。然后切取差異蛋白點，在脫色和胰酶消化后，用MALDI-TOF/ TOF-MS分析，用Mascot軟件搜索NCBInr蛋白質數據庫，蛋白質的C.I.得分大于95%則認為此蛋白有意義。

2 結果

2.1 凝膠電泳圖譜分析 用雙向電泳技術建立了阿拉善雙峰駝顆粒細胞蛋白質的2-DE圖譜（圖1）。以3倍以上的表達變化用PDQuest8.0軟件從這兩種卵泡的顆粒細胞中共檢測到了12個差異蛋白點（如圖1）。其中，點7，9，10，11，12只在大卵泡的顆粒細胞中表達，點1，6只在小卵泡的顆粒細胞中表達，其他的蛋白點在兩類卵泡的顆粒細胞中都有表達。點2，3，4，5隨著卵泡的增大而減少，點8隨著卵泡的增大而增多。

圖1 阿拉善駝不同大小卵泡顆粒細胞的蛋白質組學2-DE圖譜A：卵泡直徑小于等于10mm；B：卵泡直徑大于10mm；1～12：是差異表達的蛋白質點的編號

2.2 質譜鑒定 用MALDITOF/TOF-MS/MS鑒定12個差異蛋白點，發現它們是12種蛋白質（如表1），點1是血紅蛋白α，點2是線粒體型的ETHE1前體，點3是線粒體內的丙酮酸脫氫酶E1β亞基，點4是硫代硫酸硫基轉移酶，點5是annexin A2，點6是細胞角蛋白8，點7是一種假想蛋白，點8是血紅蛋白β，點9是蛋白激酶C，點10是COMM區域包含蛋白10樣蛋白，點11是線粒體內膜蛋白獨立島1，點12是28S核糖體蛋白S18b。這些蛋白含量的變化在圖2中詳細說明。

3 討論

3.1 丙酮酸脫氫酶E1β亞基 丙酮酸脫氫酶是線粒體內能量代謝的限速酶，催化生物體內丙酮酸轉變成乙醘輔酶A，從而參與三大營養物的最終代謝。其主要包括三類：E1、E2和E3；E1是由E1α和E1β各兩個單位組成的四聚體，已經發現丙酮酸脫氫酶E1β亞基在小鼠精子獲能過程中發生酪氨酸磷酸化，對于精子獲能過程中糖酵解的調節起到一定作用[3]。NandiS 1等[4]研究發現，隨著卵泡直徑的增加，葡萄糖濃度也隨之增加，說明個體較大卵泡需要更多葡萄糖，葡萄糖的需求量增加除了從增加外界攝入外，可能還需要抑制某些機體內葡萄糖的分解過程。并且還發現在卵泡內存在特異的葡萄糖轉運載體GLUT1和GLUT4[5]，說明葡萄糖確實作為能量物質參與卵泡發育。我們發現在大卵泡中的顆粒細胞內丙酮酸脫氫酶E1β亞基的含量少于小卵泡的顆粒細胞，這可能是隨著第3期卵泡的不斷增大，顆粒細胞的增殖不斷放慢，需要的能量也不斷減少的原因。

表1 MALDITOF/TOF-MS/MS鑒定的顆粒細胞中差異表達的蛋白質

圖2 阿拉善駝不同大小卵泡顆粒細胞中差異表達的蛋白質的含量變化

3.2 annexin A2 annexin A2是annexin家族的成員之一，annexins有20多個成員，大多數都與生殖有關。annexin A2是一種纖溶酶受體，與細胞的增殖、凋亡有關，具有RNA結合的特性，還與DNA合成、復制有關[6]。有研究發現，annexin A2和其配體S100A10的基因在小鼠多種組織中都有表達，在卵巢和子宮等生殖器官中表達水平尤為高[7]。通過RNA干擾和抗體干擾的方法表明，Annexin A2參與依賴胰島素的GLUT-4的跨膜轉運，并影響葡糖糖的轉化[8]。對雙峰駝的研究發現，大卵泡的顆粒細胞中的annexin A2含量低于小卵泡。而小卵泡需要更多的葡糖糖來增值，所以，可以推測Annexin A2的增多主要是為了滿足跨膜轉運更多的葡糖糖。但是，目前發現，GLUT-4只在肌肉細胞和脂肪細胞中表達。因此，Annexin A2是否通過GLUT-4調節顆粒細胞內的能量代謝還有待研究。

4 結論

本文首次通過研究不同直徑卵泡中顆粒細胞內的蛋白質組學，建立顆粒細胞二維電泳圖譜，經蛋白質組學和生物信息學的分析，發現丙酮酸脫氫酶E1、annexin A2可能與顆粒細胞的能量代謝有關。

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Com parative proteom iesstudy of Alax Bactrian CamelG ranulosa Cells between the different periodsof follicular development

TAO Jin-zhong1，ZHAOGuo-shun2，ZHAO Xing-xu3，HU Jun-jie3，ZHANG Yong3
（1.Agricultural College，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2.Tianshuianimal Disease Prevention and Control Center，Tianshui741600，China；3.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

The aim of this study was to identify differentially expressed proteins in the granulosa cells of Alax Bactrian Camel during follicular development.Granulosa cellswere divided into two groups according to their diameter.2-dimensional gel electro?phoresis（2-DE）was performed to analyze the granulosa cell samples.Differential proteinswere detected by PDQuest 8.0 software after stained with commassie blue.12 differentially expressed spots were observed.These spots were identified by MALDI TOF/ TOF-MS/MS.12 unique proteinswere be found.We hypothesize that pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta and an?nexin A2 play a role in the energy metabolism of granulosa cells.This study provides a solid basis for further study on granulosa cells of Alax Bactrian Camel.

two-humped Camel；proteomic analysis；follicular development；2-DE

ZHAO Xing-xu

Q 958.1

A

0529-6005（2015）11-0003-03

2015-03-24

國家自然科學基金項目（31001095）

陶金忠（1977-），男，副教授，博士，從事動物生殖生理、動物繁殖障礙、蛋白組學研究，E-mail：tao_jz@nxu.edu.cn

趙興緒，E-mail：zhaoxx@gsau.edu.cn