新疆哈薩克族人群中擴張型心肌病與核纖層蛋白A基因變異的關系

紀禹同，張紅濤，李耀東，周賢惠，李晉新，邢強，洪一帆，湯寶鵬

新疆哈薩克族人群中擴張型心肌病與核纖層蛋白A基因變異的關系

紀禹同，張紅濤，李耀東，周賢惠，李晉新，邢強，洪一帆，湯寶鵬

目的：研究新疆哈薩克族人群中擴張型心肌?。―CM）與核纖層蛋白A（LMNA）基因變異的關系。

方法：對哈薩克族一個家族性擴張型心肌病（FDCM）31名成員，特發性擴張型心肌?。↖DCM）160例患者（哈薩克族80例、漢族80例）分為IDCM組（哈薩克族,簡稱哈）、IDCM組（漢族,簡稱漢）及160例健康志愿者（哈薩克族80例、漢族80例）分為對照組（哈）、對照組（漢）進行LMNA基因檢測。提取外周血DNA，聚合酶鏈反應（PCR）擴增LMNA基因的12個外顯子和外顯子附近的內含子，對目的基因進行測序，測序結果與CHROMAS軟件和PUBMED中BLAST軟件中的標準模板進行對比，并分析突變位點與哈薩克族IDCM和漢族IDCM之間的關系。

結果：在哈薩克族FDCM的先證者中檢測到LMNA基因7號外顯子一未報道的單個堿基C插入（insC, CGG→CCG），導致精氨酸（Arg）變為脯氨酸（Pro）。在10號外顯子上，檢測到一個已被報道的LMNA基因多態位點rs4641（c.1362C＞T, His454His）。隨后，在IDCM組（哈）和其對照組的LMNA基因檢測結果中，得出LMNA基因多態位點rs4641的基因型分布（χ2=5.16，P=0.036）和等位基因頻率（χ2=4.50，P=0.034）均存在統計學意義，而在IDCM組（漢）和其對照組中卻差異無統計學意義。Logistic回歸分析顯示LMNA基因rs4641多態位點與IDCM組（哈）存在相關性[P=0.025，比值比（OR）=0.412，95%可信區間（CI）：0.189～0.896]。

結論：LMNA基因在新疆漢族和哈薩克族均有較高的患病率，但經統計后，發現LMNA基因rs4641多態位點與新疆地區哈薩克族DCM存在關聯，可能是新疆地區DCM患者發病的易感基因多態位點。

擴張型心肌病；核纖層蛋白A基因；單核苷酸多態性；基因突變

Methods: A Kazak familial dilated cardiomyopathy (FDCM) with 31 members was studied. In addition, 160 patients with idiopathic dilated cardiomyopathy (IDCM) with 160 healthy controls were enrolled in our study, and they were divided into 4 groups: IDCM-Kazak, IDCM-Han and Control-Kazak, Control-Han. n=80 in each group. Peripheral blood DNA were extracted, 12 exons with nearby introns of LMNA gene were detected by PCR and the amplifed products were sequenced and compared with the standard template of CHROMAS and BLAST software to identify mutation sites. LMNA mutation in both Kazak and Han IDCM patients were investigated.

Results: A novel LMNA mutation (insC, CGG→CCG) at exon 7 was identifed in a FDCM proband, it caused an amino acid substitution as Arg to Pro, and a known LMNA polymorphism loci rs4641 (c.1362C＞T His454His) was fund at exon 10. In addition, LMNA polymorphism loci rs4641 genotype distribution (χ2=5.16, P=0.036) and allele frequency (χ2=4.50, P=0.034) were statistically different between IDCM-Kazak group and Control-Kazak group; while such

differences were no statistic meaning between IDCM-Han group and Control-Han group. Logistic regression analysis indicated that LMNA polymorphism loci rs4641 was related to IDCM occurrence in Kazak ethnics (P=0.025, OR=0.412, 95% CI 0.189-0.896).

Conclusion: LMNA polymorphism loci rs4641 was related to IDCM in Kazak ethnics at Xinjiang area, which might be susceptible loci for IDCM occurrence.

擴張型心肌?。―CM）是一種原發性心肌疾病，其主要臨床特征是左心室或全心室擴張，引起收縮功能障礙，導致慢性心力衰竭、心律失常、猝死等心血管疾病的發生，并具有較高的發病率和死亡率。在排除已明確病因后，DCM患者中有35%～40%被診斷為特發性擴張型心肌?。↖DCM），且家族性擴張型心肌病（FDCM） 在IDCM中比率高達35%[1]，這暗示遺傳因素可能在疾病的發生發展中起到關鍵作用。2009年關于IDCM的診斷指南指出，對于DCM患者的直系親屬，也應進行基因篩查，評估患病的風險[1]。因此，對患者進行基因檢測，不僅有利于患者疾病的確診，也對其親屬的健康起到預防作用[2]。既往研究顯示，DCM多為常染色體顯性遺傳，也存在常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳[3]，多達40個基因已被確認為和DCM的發病有關[4]，其多數參與心肌的骨架、核膜和心肌蛋白、肌節蛋白和線粒體蛋白的編碼[5]。當基因編碼發生異常時，心臟的心肌細胞會出現結構與功能上的改變，導致心臟發生器質性病變，致使心肌的收縮和舒張功能下降，從而引起心肌疾病。核纖層蛋白A（LMNA），是導致DCM發病的常見基因之一，占引起FDCM的全部基因的5%～10%[6]。LMNA和C中間絲蛋白由LMN基因編碼，是構成細胞核纖層的主要部分[7]。突變的LMNA基因可以導致人類發生多達11種疾病，如傳導阻滯、骨骼萎縮、早衰癥候群等，均被稱為“核纖層蛋白病”[8]。分子遺傳學研究表明，DCM伴發傳導阻滯的患者中有30%是由LMNA基因突變引起的[9]。2005年加拿大、波蘭和愛爾蘭衛生組織聯合聲稱有4.4%的DCM是由于LMNA基因突變引發的[10]，由此可知，LMNA基因突變與DCM的存在密切聯系。

本研究選取哈薩克族FDCM的9名成員進行LMNA基因檢測，發現家系先證者存在LMNA基因rs4641突變位點。繼而收集哈薩克族和漢族的IDCM患者及健康志愿者，對與DCM相關的LMNA基因進行測序，旨在通過對新疆哈薩克族人群中DCM患者的LMNA基因研究，探究新疆哈薩克族人群中DCM與LMNA基因變異的關系。

1 資料與方法

受試者: （1） FDCM患者: 來自新疆維吾爾自治區布爾津縣的哈薩克族家系，共計31名成員（其中男性17名，女性14名，年齡在2個月～70歲），目前已有5名成員被確診為擴張型心肌病，其中已有3名成員死于擴張型心肌病，共采集血樣9例，其家系圖見圖1。 對哈薩克族FDCM進行檢測后，發現LMNA基因一突變位點與FDCM的發病可能存在關聯性，在此基礎上，收集哈薩克族和漢族IDCM患者及健康志愿者。（2） IDCM患者:均于2013-01至2014-12經新疆醫科大學第一附屬醫院的門診或住院確診為IDCM的患者。80例IDCM組（哈薩克族,簡稱哈）患者，其中男42例，女38例；80例IDCM組（漢族，簡稱漢）患者，其中男45例，女35例；同時選取160例健康志愿者為對照組，其中80例哈薩克族為對照組（哈），男37例，女43例；80例漢族為對照組（漢），男56例，女24例。本研究方案經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會同意，并且所有受試者均簽署知情同意書。

圖1 哈薩克族家族性擴張型心肌?。―CM） 家系

IDCM患者的納入標準：（1）左心室舒張末期內徑（LVEDd）＞50 mm（女）和（或）55 mm（男）；（2）左心室射血分數（LVEF）＜45%；（3）X線胸片顯示：心臟顯影擴大，心胸比例＞50%。

排除標準（診斷依據參見文獻 [11]）：引起心肌損害的其他疾病，如高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、酒精性心肌病、心包疾病、系統性疾病、肺心病和神經肌肉性疾病等。

臨床資料搜集： 包括臨床診斷，確診時的年齡，家族史，心血管病史（心肌梗死、高血壓、心肌炎），最大左心室壁厚度，LVEF等。

基因分析：抽取研究對象外周靜脈血2 ml，提取DNA，根據PUBMED上LMNA（NM_001257374.2）基因的外顯子序列，使用DNAMAN軟件設計引物（表1）。進行聚合酶鏈反應（PCR），將PCR擴增產物純化，采用DNAMAN系統對基因全部外顯子序列進行測序分析，測序結果與PUBMED中BLAST軟件和CHROMAS軟件的標準模板序列進行對比分析，確定突變位點。對存在突變的位點再進行重復測序以證實突變。

表1 核纖層蛋白基因引物序列

統計學分析 ：臨床數據以均數±標準差表示。用Hardy-Weinberg平衡檢測樣本的群體代表性。直接計數法計算基因型分布和等位基因頻率，基因型分布和等位基因頻率采用卡方（χ2）檢驗。計量資料采用方差分析。數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

FDCM患者：FDCM患者中5名成員被確診為FDCM（本研究中FDCM僅涉及家系的直系成員），先證者的父親病逝于心血管疾病，具體不詳。

IDCM組（哈）、 IDCM組（漢）及其對照組基線資料（表2）：IDCM組（哈）與其對照組比較LVEF降低、LVEDd升高，差異均有統計學意義（P均＜0.01）。IDCM組（漢）與其對照組比較LVEF也降低、LVEDd升高，差異均有統計學意義（P均＜0.01）。其余指標間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 特發性擴張型心肌病組（哈）、（漢） 及其對照組基線資料

表2 特發性擴張型心肌病組（哈）、（漢） 及其對照組基線資料

注：LVEF：射血分數；LVEDd：左心室舒張末期內徑；IDCM：特發性擴張型心肌病。與對照組（哈）比較*P＜0.01; 與對照組（漢） 比較ΔP＜0.01

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基因檢測的結果：對目的基因進行檢測后，在FDCM先證者的7號染色體上發現一未報道的突變位點，在FDCM發現一已報道的SNP位點rs4641。同樣，在IDCM及對照者中也發現LMNA基因SNP位點rs4641。對LMNA基因的其余外顯子和附近的內含子均未檢測到突變位點。對既往文獻中提過的與DCM相關的LMNA基因SNP位點（rs553016、rs505058、rs142000963、rs17847249等）再次重復檢測，也并未發現突變。（1）FDCM突變位點：FDCM中，在先證者Ⅲ-5的1號染色體上的7號外顯子中，檢測到一個堿基的插入，導致其后的堿基序列發生變化，在第1066位堿基處插入胞嘧啶C（ins C，CCGGG→CCCGG），導致精氨酸（Arg）變為脯氨酸（Pro）。先證者的基本資料和臨床資料顯示，患者男，33歲，哈薩克族，因活動后胸悶、氣短入院。體格檢查：端坐呼吸，頸靜脈怒張，右下肺叩診濁音，未聞及濕啰音，心界向左下擴大，心音減弱，呈奔馬律，肝肋下4指，肝頸靜脈回流征陽性。已病逝。心電圖顯示：竇性心動過速、完全性右束支傳導阻滯。超聲心動圖顯示：全心腔擴大，LVEF：33%，LVEDd：71 mm，左心房68 mm，心包積液（23 mm液性暗區），心功能減低。X線胸片顯示：心影增大，心胸比例＞0.5。同時，在FDCM的9名成員中，檢測出已被發現的LMNA基因多肽位點rs4641，c.1362C＞T（rs4641，His454His，NM_001257374.1），位于10號外顯子，該位點導致CAC→CAT，堿基發生改變，并沒有導致氨基酸出現改變（圖2）。（2）

IDCM的LMNA基因SNP位點（圖3、表3和4）：對IDCM組（哈）、（漢）及其對照組進行了rs4641的檢測，結果表明rs4641在哈薩克族和漢族基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗，具有群體代表性。rs4641在IDCM組（哈）和對照組（哈）之間的CC、CT、TT基因型分布 （χ2=5.16，P=0.036）及C和T等位基因頻率（χ2=4.50，P=0.034） 差異均有統計學意義。而IDCM組（漢）和對照組（漢）之間的CC、CT、TT基因型分布（χ2=0.55，P=0.578）及C和T等位基因頻率 （χ2=0.47，P=0.489） 差異均無統計學意義。經Logistic回歸分析顯示LMNA基因rs4641多態位點與哈薩克族IDCM患者存在相關性[比值比 （OR）=0.412, 95%可信區間（CI）：0.189～0.896，P=0.025]，rs4641可能是哈薩克族IDCM患者發病的易感基因多態位點。

圖2 哈薩克族家族性擴張型心肌?。―CM）先證者核纖層蛋白基因突變

表3 兩組患者核纖層蛋白基因的Hardy-Weinberg檢測[例（%）]

圖3 核纖層蛋白基因 多態位點rs4641

表4 rs4641基因型分布和等位基因頻率在漢族和哈薩克族之間的比較[例（%）]

3 討論

擴張型心肌病是導致心臟猝死和慢性心力衰竭的常見原因之一，是一種遺傳因素和非遺傳因素共同起作用的心肌疾病。LMNA基因是DCM最常見的致病性基因之一，位于1號染色體，全長56.7 kb，包含12個外顯子，核纖層蛋白單體多聚形成蛋白網絡狀的核纖層，LMNA蛋白與其他核膜結構蛋白相互作用，組成細胞核膜，維持核膜穩定[12,13]。LMNA基因的突變大多可以導致DCM[14]。既往研究表明，LMNA基因突變導致的IDCM，在發病早期，患者的癥狀輕微或者并不明顯，因此很難檢測出，只有發展到后期，才會出現射血分數下降等一系列的表現，所以LMNA基因突變引起的心肌疾病多是以傳

導系統的改變作為首發癥狀，如室性和房性心律失常、傳導阻滯等[15]。rs4641突變的IDCM患者中有67%存在心律失常，如室性心動過速，Ⅱ度Ⅱ型房室傳導阻滯等。本研究中的FDCM先證者首發癥狀為完全性右束支傳導阻滯，后期才表現胸悶、氣短等癥狀。LMNA基因不同位置的突變導致不同的臨床癥狀[16]，Michels等[17]發現LMNA基因Argl90Trp不會導致患者出現傳導阻滯的現象，FDCM患者中LMNA基因Ar9541Cys突變導致的心尖部室壁瘤是其首發癥狀，并且不伴有傳導阻滯的表現[18]。這就可以解釋為何本研究中的IDCM患者并不是100%出現心律失常。

研究中FDCM中的先證者檢測出一個罕見報道的突變位點，堿基的插入導致整個密碼子序列的發生改變，同時其也存在rs4641多態位點，這說明LMNA基因導致DCM的發生，可能是多個突變位點相互作用的結果，但是這一突變位點是否是其主要的致死原因，是否會遺傳到下一代？本研究并未收集到FDCM中其他DCM患者的血標本。與此同時，美國Brodt等[19]研究表明隨著年齡的增長，攜帶LMNA基因的DCM患者的外顯率會增加。因此，本研究將繼續對哈薩克族FDCM家族的其他成員進行定期檢查和基因檢測，并探究是否存在其余與DCM相關的基因。

單核苷酸多態性是人類遺傳變異中最常見的一種，可達到突變基因的90%。研究中rs4641多態位點在哈薩克族的IDCM和健康志愿者中占38%，在漢族占48%，漢族的發病率比哈薩克族的高，但是漢族存在rs4641多態位點的患者與漢族志愿者比較沒有統計學意義，而哈薩克族卻存在。這是因為新疆地處偏遠地區，且哈薩克族的飲食、生活習慣、居住環境等方面與漢族人群不同，最重要的是哈薩克族人口較少，且存在民族之間通婚的原因，導致突變的基因傳到下一代的可能性大。漢族rs4641的檢測率為48%，說明雖然遺傳因素占有很大比重，但是環境等外界因素同樣影響著DCM的發生。這與本研究的結果正好相符。

結論：LMNA基因多態位點rs4641可能是新疆哈薩克族DCM患者的易感基因多態位點，因此，對患者進行基因測序有助于疾病的早期診斷，并能夠及時治療和預防。同時，基因測序使疾病的診斷變得快速、簡單，也可以在基因組水平上對患者進行醫療診治和保健，并且對于評估FDCM的家庭成員是否存在DCM的風險是有一定意義的，故對無癥狀的IDCM患者進行早期診斷，可以起到預防的作用[20]。

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Relationship Between Dilated Cardiomyopathy and Nuclear Lamina Protein A Gene Mutation in Kazak Ethnics at Xinjiang Area

JI Yu-tong, ZHANG Hong-tao, LI Yao-dong, ZHOU Xian-hui, LI Jin-xin, XING Qiang, HONG Yi-fan, TANG Bao-peng.
Pacing and Electrophysiology Department, the First Affliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi (830054), Xinjiang, China

Objective: To study the relationship between dilated cardiomyopathy and nuclear lamina protein (LMNA) gene mutation in Kazak ethnics at Xinjiang area.

Dilated cardiomyopathy; Nuclear lamina protein A gene; Single nucleotide polymorphisms; Gene mutation (Chinese Circulation Journal, 2015,30:1071.)

2015-05-12）

（編輯：梅 平）

國家自然科學基金（編號：81260069 ）

830054 新疆維吾爾自治區烏魯木齊市，新疆醫科大學第一附屬醫院 起搏電生理科 （紀禹同、李耀東、周賢惠、李晉新、邢強、洪一帆、湯寶鵬）；新疆維吾爾自治區阿勒泰地區布爾津縣人民醫院 內一科(張紅濤)

紀禹同 碩士研究生 主要研究方向為心律失常學 Email：jytx2007@126.com 通訊作者：湯寶鵬 Email：tangbaopeng1111@163.com

R541

A

1000-3614（2015）11-1071-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.010