人參皂苷Rg1對心肌細胞的影響及其信號傳導機制

劉燃，宋蕊，袁麗，凌露，楊萍，郭家智，張戈，陸地，孫林

人參皂苷Rg1對心肌細胞的影響及其信號傳導機制

劉燃，宋蕊，袁麗，凌露，楊萍，郭家智，張戈，陸地，孫林

目的：從細胞和分子層面探討人參皂苷Rg1（G-Rg1）對心肌細胞的影響及其信號傳導機制。

方法：體外培養大鼠H9c2心肌細胞，按實驗要求隨機分13組，每組5個平行孔，分別為空白對照組，單純缺血缺氧2 h、6 h、12 h、24 h、48 h組，G-Rg1 5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L組，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的特異性抑制劑（YC-1）組，YC-1+G-Rg1組，蛋白激酶B（Akt）蛋白的磷酸化特異性抑制劑（Wortmannin）組，Wortmannin+G-Rg1組。檢測G-Rg1、缺血缺氧以及YC-1對心肌細胞活力及心肌細胞損傷的影響。同時用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測心肌細胞內HIF-1α、葡萄糖載體蛋白-1（GLUT-1）和血紅素氧合酶-1（HO-1）的信使核糖核酸mRNA表達水平變化。用蛋白質免疫印跡法檢測HIF-1α、GLUT-1和HO-1、活化轉錄因子-6（ATF-6）、抑制CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）和Akt等細胞信號通路蛋白表達水平變化。

結果：缺血缺氧時間與心肌細胞活力呈負相關（r=-0.8580，P＜0.05），與乳酸脫氫酶溢出率呈正相關（r=0.9201，P＜0.05）。G-Rg1 10 μmol/L組較單純缺血缺氧24 h組細胞活力明顯回升（87.8%、62.6%，P＜0.05），細胞培養上清乳酸脫氫酶（LDH）含量明顯減少（25.0%、74.8%，P＜0.05），且上調了HIF-1α、GLUT-1、HO-1的mRNA表達水平（P＜0.05）。蛋白質免疫印跡法分析顯示：YC-1+G-Rg1組較G-Rg1組，心肌細胞活力下降（68.0%，87.8%，P＜0.05），細胞培養上清LDH含量增加（56.4%，25.0%，P＜0.05），同時YC-1拮抗了G-Rg1對HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白表達水平的調控（P＜0.05）；Wortmannin可拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平的調控（P＜0.05），及對Akt兩個磷酸化位點的激活作用（P＜0.05）。

結論：心肌細胞損傷程度與缺血缺氧時間有關；G-Rg1對心肌細胞具有保護作用，其機制激活HIF-1α及其下游因子的表達并抑制了內質網應激效應，可能與G-Rg1激活Akt有關。

人參皂苷Rg1；磷脂酰肌醇3激酶；缺氧誘導因子-1α；內質網應激；凋亡

Methods: H9c2 cells were cultured and treated in different conditions by following groups:①Blank control group, ②Hypoxia alone group, the cells were treated for (2, 6, 12, 24, 48) hr respectively, ③G-Rg1 group, the cells were treated by G-Rg1 at (5, 10, 50) μmol/L respectively,④YC-1 group, which is the specifc inhibitor of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), ⑤YC-1 + G-Rg1 group, ⑥Wortmannin group, which is the specifc inhibitor for protein kinase B (Akt) phosphorylation and ⑦Wortmannin + G-Rg1 group. Each experiment was conducted with 5 replicates. The effects of G-Rg1, hypoxia and YC-1 on cell activity and injury were studied; intracellular mRNA expressions of HIF-1α, glucose

transporter-1 (GLUT-1) and heme oxygenase-1 (HO-1) were examined by RT-PCR; protein expressions of HIF-1α, GLUT-1, HO-1, activating transcription factor-6 (ATF-6), CCAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) and Akt with its signal pathway factors were measured by Western blot analysis.

Results: The time of hypoxia was negatively related to cell activity (r=-0.8580, P＜0.05) and positively related to LDH overfow rate (r=0.9201, P＜0.05). G-Rg1 (10μmol/L) group showed increased cell activity than Hypoxia alone (24 hr) group (87.8% vs 62.6 %, P＜0.05), while decreased LDH overfow (25.0% vs 74.8%, P＜0.05), and up-regulated mRNA expressions of HIF-1α, GLUT-1 and HO-1, P＜0.05. YC-1+ G-Rg1 group had decreased cell activity than G-Rg1 group (68.0% vs 87.8%, P＜0.05), while increased LDH overfow (56.4% vs 25.0%, P＜0.05). Meanwhile, YC-1 clashed the effect of G-Rg1 on protein expressions of HIF-1α, GLUT-1, HO-1, ATF-6 and CHOP, P＜0.05; wortmannin clashed the effect of G-Rg1 on protein expressions of HIF-1α, CHOP, P＜0.05 and suppressed the two phosphorylation sites for Akt activation, P＜0.05.

Conclusion: G-Rg1 may protect rat’s H9c2 cells in vitro by activating expressions of HIF-1α with its downstream factors and inhibiting endoplasmic reticulum stress, which might be related to the effect of G-Rg1 on Akt activation.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1096.)

人參皂苷Rg1（G-Rg1）是人參、三七等人參屬藥材的主要活性成分之一，有促進海馬神經生長[1]以及對心血管系統的保護作用[2，3]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（Akt），參與了多種細胞功能的調節，在細胞存活和抗凋亡中起重要作用。心肌細胞缺血缺氧時，其功能、代謝和結構均可能發生變化，同時可表達缺氧誘導因子-1（HIF-1），受缺氧信號調控的HIF-1α是活性亞基，HIF-1的下游基因涉及能量代謝、血管新生、鐵與血紅素的代謝以及一氧化氮的合成等。內質網應激（ERS）與許多心血管疾病有關，其中抑制CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）是內質網應激介導細胞凋亡的主要通路[4]。研究證明作為依賴缺血缺氧表達的HIF-1和ERS相關因子有潛在的聯系[5]。那兩者之間是否會存在交叉通路的調控現象，互相影響各自的下游基因表達；G-Rg1對心肌細胞的保護作用是否與抑制ERS介導的細胞凋亡有關，本研究做進一步探討。

1 材料與方法

主要儀器及試劑：蛋白電泳系統、逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）儀、水平電泳系統和凝膠成像儀（BIO-RAD,美國）；普通培養箱及三氣培養箱（Theromo electron Corporation, 美國）；G-Rg1（純度≥98%，由昆明制藥廠提供）；Wortmannin及YC-1（Sigma-Aldrich Co. LLC, 美國）；HIF-1α（Novus Biologicals, 美國）；GLUT-1（Millipore,Germany）；血紅素氧合酶-1（HO-1）、活化轉錄因子-6（ATF-6）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（內參，GAPDH）（Santa Cruz Biotechnology, 美國）；Akt、phosphor-Akt （Ser473）、phosphor-Akt （Thr308）和CHOP（Cell Signaling technology, 美國）；所有PCR引物（Invitrogen Corporation，中國）。

分組：使用10%小牛血清 DMEM/F12 高糖培養液（于2014年購自Santa Cruz Biotechnology, 美國）培養大鼠H9c2心肌細胞（于2014年由廣東醫學科學研究中心林秋雄教授饋贈），以 1×106個/ml濃度接種于底面積25 cm2培養瓶中，將細胞置于細胞培養箱（37℃，5% CO2飽和濕度）中培養，每隔兩天傳代。因前期預實驗發現進行細胞饑餓同步化處理后，使心肌細胞提前出現應激狀態導致后續實驗結果不穩定，故當細胞密度均勻生長至 80%～90%時，隨機分13組，每組5個平行孔。空白對照組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基繼續進行培養，不作任何處理；單純缺血缺氧2 h、6 h、12 h、24 h、48 h組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后進行缺氧，使用1%O2的三氣培養箱，處理H9c2心肌細胞 2 h、6 h、12 h、24 h和48 h；G-Rg1 5 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后再分別加入5、10和50 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，而后再置入三氣培養箱處理12 h、24 h和48 h；HIF-1α的特異性抑制劑（YC-1）組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后使用10 μmol/L YC-1處理細胞 15 min，置入三氣培養箱處理24 h；YC-1+G-Rg1組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后使用10 μmol/L

YC-1處理細胞 15 min，而后用10 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，最后置入三氣培養箱處理24 h；蛋白激酶B（Akt）蛋白的磷酸化特異性抑制劑（Wortmannin）組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后使用1 μmol/L Wortmannin 處理細胞 15 min，置入三氣培養箱處理24 h。Wortmannin+G-Rg1組：將高糖培養液置換為無血清 DMEM低糖培養基后使用1 μmol/L Wortmannin 處理細胞 15 min，而后用10 μmol/L G-Rg1處理細胞0.5 h，最后置入三氣培養箱處理6 h、24 h。

細胞活性測定[3]：培養細胞單層鋪滿 96孔平底板，選取細胞密度均一、狀態良好的細胞進行實驗，每組設十個孔。按說明書依次加入相應試劑后，酶標儀 OD 550 nm 處測量各孔的吸光值并記錄數據。同樣實驗條件，重復五次。復孔數據求相應均值后依據公式：（缺血缺氧板OD值—空白對照組OD值）/（對照板OD值—空白對照組OD值）求出相應的細胞相對活性。

細胞乳酸脫氫酶（LDH）溢出率測定[6]：按上述的細胞分組處理細胞，不同培養時間后用移液器吸盡培養瓶內的細胞培養上清至高壓滅菌的離心管中。向培養瓶內加入1 ml 0.5% TritonX-100，置于普通培養箱，20 min 后用移液器吸盡培養瓶內細胞裂解液至另一批高壓滅菌的離心管中。按說明書依次加入相應試劑后，酶標儀 OD 340 nm 處測量各孔的吸光值并記錄數據。同樣實驗條件，重復五次。復孔數據求相應均值后依據公式：LDH（U/L）=（測定OD值 — 對照OD值）/（標準OD值 — 空白OD值）×標準品濃度（0.2 mmol/L）×1000求出細胞培養上清和細胞裂解液各自的LDH含量，再依據公式：LDH%=細胞培養上清LDH/（細胞培養上清LDH+細胞裂解液LDH）× 100%求出相應各組的細胞LDH溢出率百分比。

RT-PCR檢測：細胞總RNA提取后進行純度和濃度測定，按說明書行cDNA逆轉錄。所有引物已用PubMed BLAST進行引物來源、引物反應條件、引物長度和引物鏈配對等檢測。各基因引物系列見表1。并按照相應反應條件進行PCR擴增，完成后將PCR產物鑒定并定量分析，電泳完成后將瓊脂糖膠置于 Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統中拍照采集圖像，Quantity one 4.4.0 計算各條帶的熒光強度值及其與GAPDH的比值進行定量分析。同樣實驗條件，重復五次。

蛋白質免疫印跡法檢測：蛋白質提取后定量，進行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，而后使用半干轉移系統轉膜，完成后按照抗體說明書按一定比例依次加入一抗、二抗進行孵育，孵育最佳時間后進行化學發光、顯影、定影、拍照并晾干。用掃描儀掃描圖片后進行灰度分析。同樣實驗條件，重復五次。

表1 各基因引物序列

2 結果

缺血缺氧時間與細胞損傷的關系（表2）：缺血缺氧時間與心肌細胞活力呈負相關（r=-0.8580，P＜0.05），與細胞培養上清LDH含量呈正相關（r=0.9201，P＜0.05），驗證了體外缺血缺氧模型的建立。RT-PCR分析顯示HIF-1α、葡萄糖載體蛋白-1（GLUT-1）和HO-1在心肌細胞缺血缺氧2 h出現mRNA表達高峰。

表2 缺血缺氧時間與細胞損傷的關系

表2 缺血缺氧時間與細胞損傷的關系

注：LDH：細胞乳酸脫氫酶；RT-PCR：逆轉錄聚合酶鏈反應。與空白對照組比*P＜ 0.05。余注見表1

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不同劑量G-Rg1對心肌細胞的作用（圖1）：分別用5 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L的濃度梯度G-Rg1預處理心肌細胞，發現的G-Rg110 μmol/L組較

單純缺血缺氧24 h組細胞活力明顯回升（87.8%、62.6%，P＜0.05），細胞培養上清LDH含量明顯減少（25.0%、74.8%，P＜0.05），且上調了HIF-1α、GLUT-1、HO-1的信使核糖核酸mRNA表達水平（P＜0.05）。

圖1 濃度梯度的G-Rg1 對心肌細胞內三個因子信使核糖核酸表達的RT-PCR 圖

G-Rg1可抑制內質網應激介導的細胞凋亡（圖2）：蛋白質免疫印跡法分析顯示：YC-1+G-Rg1組較G-Rg1組，心肌細胞活力下降（68.0%，87.8%，P＜0.05），細胞培養上清LDH含量增加（56.4%，25.0%，P＜0.05）。同時YC-1拮抗了G-Rg1對HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白表達水平的調控（P＜0.05）。

圖2 YC-1拮抗G-Rg1對心肌細胞內HIF-1α、GLUT-1、HO-1、ATF-6和CHOP的蛋白水平的調控作用的蛋白質免疫印跡法圖

G-Rg1通過激活Akt信號通路抑制了CHOP介導的心肌細胞凋亡（圖3、4）：蛋白質免疫印跡法分析顯示用Wortmannin預處理后，可拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平的調控（P＜0.05）。同時可拮抗G-Rg1在對Akt兩個磷酸化位點的激活作用（P＜0.05）。

圖3 Wortmannin拮抗G-Rg1對HIF-1α和CHOP的蛋白表達水平調控的蛋白質免疫印跡法圖

圖4 Wortmannin拮抗G-Rg1對Akt的蛋白磷酸化調控的蛋白質免疫印跡法圖

3 討論

HIF-1α是缺血前預處理和遠端缺血預處理起到心肌保護作用的關鍵調控基因[7，8]，經脯氨酸羥

化酶（PHD）羥化修飾后降解，缺氧、藥物等刺激抑制PHD活性，使HIF-1α蛋白迅速增加，HIF-1α與HIF-1β聚合形成異二聚體，發揮轉錄因子的作用，調節靶基因的表達。缺氧時，HIF-1α可激活心肌營養蛋白-1以抑制心肌凋亡[9]，同時抑制心肌過度收縮，以保持降低能量代謝[10]。當氧化磷酸化過程受抑制時，HIF-1通過誘導GLUT-1和糖酵解酶類以增加糖酵解，滿足心肌對能量代謝的需要。HO-1可催化降解血紅素產生鐵離子、膽紅素和一氧化碳，能抑制動脈斑塊和粥樣硬化的形成及發展并保護心肌。本研究發現HIF-1α、GLUT-1和HO-1 三個內源性保護因子的mRNA表達高峰出現在缺血缺氧2 h時，通過G-Rg1預處理后，可使三個因子mRNA表達水平和蛋白水平的高峰明顯延長，起到更長時間的保護作用。

適度的ERS是種細胞保護機制，可使內質網固有分子伴侶增加、蛋白質翻譯受抑制、未折疊蛋白的降解增加或自噬作用增強。研究發現G-Rg1可抑制神經毒性致內質網應激介導的細胞凋亡[11]。CHOP基因缺陷小鼠可避免缺血再灌注引起的心肌細胞炎癥及凋亡[12]。適當的ERS可增加ATF-6表達，以增強心肌在缺血再灌注中的生存能力[13,14]，同時還可以抑制由CHOP介導的細胞凋亡[15]。一些ERS分子伴侶如HO-1等可同時由ATF-6和HIF-1誘導表達。心肌梗死后，使用HIF-1的下游因子促紅細胞生成素的注射治療，可抑制CHOP介導的凋亡，保護缺血心肌以改善心功能[16]。本研究發現G-Rg1激活HIF-1α后上調了ATF-6表達，同時下調了CHOP的表達，抑制HIF-1α表達后明顯削弱了G-Rg1對CHOP表達的抑制效應，提示HIF-1可能位于ATF-6、CHOP的調控上游。但CHOP的下調與ATF-6的上調是否有關，本研究尚未探討。

PI3-K/Akt信號通路在缺血缺氧誘導的損傷反應中發揮了保護作用，而PI3K/Akt信號通路可調控HIF-1α其下游因子， G-Rg1可抑制脂多糖誘導炎性蛋白酶及促炎性細胞因子的表達[17]，也可以通過PI3K/Akt信號通路上調HIF-1α及其下游基因，提示PI3K/Akt位于HIF-1α和CHOP的調控上游。本研究證實G-Rg1先激活PI3-K/Akt信號通路Akt的兩個磷酸化位點后，再上調了HIF-1α及其下游保護因子的表達，起到保護心肌細胞的作用，并通過上調HIF-1α的表達以抑制內質網應激介導的凋亡因子CHOP的表達，減少了心肌細胞的傷亡。初步證實了作為依賴缺血缺氧表達的HIF-1和ERS相關因子之間存在交叉通路的調控現象，G-Rg1對心肌細胞的保護作用與抑制ERS介導的細胞凋亡有關。這些發現解釋了G-Rg1發揮其保護效應涉及到的部分信號通路之間的調控關系。隨著越來越多G-Rg1機制學研究的完善，可使其成為臨床上用于保護心肌細胞的關鍵藥物。

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Effect of Ginsenoside-rg1 on Rat's Cardiomyocytes With its Mechanism of Signal Pathway in vitro

LIU Ran, SONG Rui, YUAN Li, LING Lu, YANG Ping, GUO Jia-zhi, ZHANG Ge, LU Di, SUN Lin.
Department of Cardiology Third Ward, The second Affliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming (650101), Yunnan, China
Co-corresponding Authors: SUN Lin, Email: sunlinkm@sina.com and LU Di, Email: ludi20040609@126.com

Objective: To investigate the effect of ginsenoside-rg1 (G-Rg1) on rat’s cardiomyocytes H9c2 with its mechanism of signal pathway in vitro.

Ginsenoside-rg1; Phosphoinositide-3 kinase; Hypoxia inducible factor-1α; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

2015-03-31）

（編輯：王寶茹）

國家自然科學基金（81260061）；云南省科技廳-昆明醫科大學聯合專項基金（2012FB046、2014FB047）；云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項重點項目（2013FB101）

650101 云南省昆明市，昆明醫科大學第二附屬醫院 心內科三病區（劉燃、宋蕊、袁麗、凌露、張戈、孫林）；昆明醫科大學生物醫學工程中心（楊萍、郭家智、陸地）

劉燃 住院醫師 碩士 主要從事冠心病及缺血再灌注損傷研究 Email：179143498@qq.com 通訊作者：孫林 Email：sunlinkm@sina.com陸地 Email：ludi20040609@126.com

R54

A

1000-3614（2015）11-1096-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.11.015