高遷移率蛋白B1對肝細胞癌血管生成的影響*

楊倩，鄧菊慶，馮曉潔，莊利萍，于璐，孫潔

（昆明醫科大學附屬甘美醫院病理科，云南 昆明 650011）

·論著·

高遷移率蛋白B1對肝細胞癌血管生成的影響*

楊倩，鄧菊慶，馮曉潔，莊利萍，于璐，孫潔

（昆明醫科大學附屬甘美醫院病理科，云南 昆明 650011）

目的探討高遷移率蛋白B1（HMGB1）在人肝細胞癌組織中的表達及其與血管生成的關系。方法選擇30例肝細胞癌，運用免疫組織化學方法檢測HMGB1和血管內皮生長因子（VEGF）的表達，并測定微血管密度，進行統計學相關性分析。結果HMGB1和VEGF在肝細胞癌中呈強弱不等的表達，總陽性率分別為20/30（66.7%）和23/30（76.7%），高于癌旁組織及正常對照組織（P＜0.05），并且HMGB1與VEGF的表達具有相關性（r=0.408，P＜0.05）。HMGB1與肝細胞癌微血管密度正相關（r=0.529，P=0.008）；當HMGB1陽性細胞數＜25%時，微血管密度無明顯增加；當陽性細胞數＞25%時，癌組織微血管密度增加。結論在肝細胞癌中，HMGB1與VEGF表達上調有關，與肝細胞癌血管生成相關，HMGB1可能參與了腫瘤血管生成。

高遷移率蛋白B1；血管內皮生長因子；肝細胞癌；腫瘤血管生成；微血管密度

高遷移族蛋白1（high mobility group protein box-1，HMGB1）在多種人類惡性腫瘤中存在高表達，與腫瘤的侵襲、轉移密切相關。而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知作用最強的血管生長因子之一。本研究應用免疫組織化學染色方法對肝細胞癌組織中HMGB1、VEGF表達進行檢測，并檢測肝癌組織微血管密度（microvessel density，MVD），研究HMGB1與VEGF表達及其與微血管生成的關系，從而探討HMGB1在肝細胞癌血管生成中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料

標本來自2008年1月-2011年3月昆明醫科大學附屬甘美醫院肝膽外科的原發性肝癌患者30例。以距癌灶邊緣5 cm為分界分別留取肝癌癌灶組織和非癌組織。其中，男24例，女6例；年齡36～75歲，平均（59.6±10.5）歲；瘤體＜5cm 16例，瘤體≥5cm 14例。所有標本均經病理組織學證實為原發性肝細胞肝癌，術前患者未行任何治療。另取5例正常肝組織為對照組。標本常規脫水、4%甲醛固定、石蠟包埋，連續切片（片厚4μm）。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法免疫組織化學采用SP法，兔抗人HMGB1多克隆抗體購自美國PTG公司，VEGF及CD34抗體購自美國Gene公司，SP免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照，以已證實HMGB1、VEGF、CD34染色陽性的肝癌標本作陽性對照。

1.2.2微血管計量采用免疫組織化學法（同上），以CD34為指標，參考WEIDNER等[1]報道的微血管計量方法，即每一個染成棕黃色，可與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織區分開的內皮細胞或內皮細胞簇，不論管腔和紅細胞出現與否，均作為一個單一的、可計數的血管。取實驗組織中HMGB1表達計為陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性（0，1，2，3分）的切片，于400倍視野內計數微血管，各取5個高倍視野的均值，四舍五入后作為MVD值（微血管個數/0.42 mm2）。由2名病理科醫師采用雙盲原則評定。1.2.3結果判斷①HMGB1定位于細胞質和胞核，呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。每張切片在高倍鏡下（×200）隨機觀察5個視野，計數200個細胞/視野，陽性細胞數＜10%為表達陰性（-），陽性細胞數10%～25%為表達弱陽性（+），陽性細胞數26%～50%為表達中等強度陽性（++），陽性細胞數＞50%為表達強陽性（+++），分別計為0，1，2，3分。②VEGF定位于細胞漿和胞膜，呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。以胞漿及胞膜著色強度打分：強陽性計為3分，陽性計為2分，弱陽性計為1分，陰性計為0分。1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行Spearman相關分析及非參數檢驗（Kruskal-Wallis法），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HMGB1的表達

在30例肝細胞癌標本中，HMGB1總陽性率為66.7%（20/30），其中強陽性3例，陽性13例，弱陽性4例，陰性10例。癌旁組織中HMGB1總陽性率為40%（12/30），均為弱陽性。正常對照組織5例，無HMGB1表達。見圖1。

圖1 免疫組織化學顯示HMGB1在肝癌組織中呈陽性表達，定位于細胞核（×100）

2.2VEGF的表達

在30例肝細胞癌標本中，VEGF總陽性率為76.7%（23/30），其中強陽性7例，中度陽性13例，弱陽性3例，陰性7例。癌旁組織中VEGF總陽性率為46.7%（14/30），均為弱陽性。正常對照組織5例，2例出現小灶狀VEGF弱表達。在血管和膽管中有時可見VEGF弱表達。見圖2。

圖2 免疫組織化學顯示VEGF在肝癌組織中呈陽性表達，定位于胞漿（×100）

2.3HMGBI與VEGF表達的關系

在同一個病例中，HMGB1和VEGF的表達是不均一的，可以表現為部分肝細胞陽性而部分為陰性；然而，在這些病例里發現，HMGB1和VEGF在同一部位有著相似的表達，同為陰性或同為陽性。見圖3～6。

對于多個區域的HMGB1和VEGF的強度表達進行采樣及分析，采用SPSS 18.0統計軟件進行

Spearman相關分析，HMGB1與VEGF表達存在相關性，相關系數r=0.408，P=0.025。

圖3 HMGB1在肝癌組織中呈陽性表達（×40）

圖4 在肝細胞癌中，VEGF與HMGB1的陽性表達一致（×40）

圖5 HMGB1在部分膽管上皮內可呈陽性表達（×100）

圖6 VEGF在同一膽管上皮內呈陽性表達（×100）

2.4HMGBI與微血管密度的關系

在20例有HMGB1表達的病例中，選取癌組織表達HMGB1為陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性（0，1，2，3分）的視野，進行微血管密度測定及分析。結果：HMGB1與微血管密度正相關（相關系數r= 0.529，P=0.008）；HMGB1陰性與HMGB1弱陽性組微血管密度差異無統計學意義（秩均值5.67、6.78，P=0.643＞0.05）；中度陽性與強陽性組微血管密度差異無統計學意義（秩均值6.94、5.17；P=0.459＞0.05）；弱陽性與中度陽性組微血管密度具有統計學差異（秩均值5.83、13.17；P=0.004＜0.05），弱陽性與強陽性組微血管密度差異有統計學意義（秩均值5.06、10.83；P=0.016＜0.05）。在肝細胞癌中，當HMGB1陽性細胞數＜25%時，微血管密度無明顯增加；當陽性細胞數＞25%時，癌組織微血管密度增加。見圖7。

圖7 肝細胞癌微血管密度增加（×200）

3 討論

HMGB1最初發現時是一種廣泛存在的DNA結合蛋白，一般情況下，HMGB1在多數細胞中呈基礎水平表達，它參與DNA的轉錄、復制、修復以及細胞運動等。隨著研究的深入，發現HMGB1可作為一種細胞因子，在巨噬細胞、單核細胞受內毒素、IL-1、TNF刺激后均能釋放。HMGB1還可由受損或壞死細胞釋放。在腫瘤的發生、發展研究方面，已發現HMGB1與多種腫瘤的侵襲和轉移有關[2]。

一些報道提示，HMGB1與腫瘤血管生成有關：HMGB1及其受體RAGE的結合會導致NF-κB的激活，進而使白細胞黏附分子和前炎癥反應分子及血管生成因子表達上調[3]；HMGB1與肝磷脂形成的復合物也能促進血管生成[4]；在體內外實驗中，人們利用抗體封閉HMGB1后，發現血管生成受到抑制[5]。MITOLA等[6]報道在體外實驗中，HMGB1可以激活內皮細胞的MAPK細胞外信號調解激酶（EPK）1/2信號活化，促進內皮細胞增殖、修復機械性受損的內皮細胞。HMGB1也可以通過直接活化內皮祖細胞和造血干細胞，動員其遷移至缺血區域，來促進血管新生[7]。

VEGF是目前比較明確的血管生長因子，癌細胞的生長、轉移依賴新生血管的形成，VEGF在肝癌中高表達，對肝癌新生血管形成及腫瘤生長和轉移起

重要作用。在鱗狀細胞癌、肺癌、腎母細胞瘤等多種腫瘤中，HMGB1與VEGF的關系已有文獻報道[8-9]。在肝細胞癌中，也發現HMGB1與微血管生成相關[10]。研究發現，HMGB1與VEGF-A的生成相關，阻斷HMGB1通路使得視網膜細胞株（RGC-5）中VEGFA減少[11]。SASAHIRA等運用重組人HMGB1蛋白作用于口腔鱗狀細胞癌細胞后，能促進腫瘤細胞VEGF的表達，亦從體外細胞水平為HMGB1參與到腫瘤血管生成過程中提供了實驗證據[12]。

本研究發現HMGB1與VEGF蛋白在肝細胞癌組織中的表達呈正相關，提示在肝細胞癌血管生成過程中，異常表達增高的HMGB1與VEGF存在相關性?？赡艽嬖贖MGB1為促血管生成因子VEGF的上調提供了協同作用。另外，當HMGB1表達達到一定程度（＞25%）時，癌組織微血管密度增加，提示HMGB1對腫瘤新生血管的作用可能在一定范圍內呈量效關系。HMGB1可作為評估肝細胞癌腫瘤血管生成的一個觀測指標，可能成為阻斷肝癌血管生成的有效靶點。

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（張蕾 編輯）

Effect of high moboility group box 1 protein on angiogenesis in hepatocellular carcinoma*

Qian YANG,Ju－qing DENG,Xiao－jie FENG,Li－ping ZHUANG,Lu YU,Jie SUN
(The Affiliated Galmette Hostpital,Kunming Medical University, Kunming,Yunnan 650011,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of high mobility group box 1 protein(HMGB1)in hepatocellular carcinoma and its relationship to tumor angiogenesis.【Methods】The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of HMGB1 and vascular endothelial growth factor(VEGF)in the hepatocellular carcinoma tissue and paracancerous tissue of 30 patients.Microvessel density(MVD)was also measured.【Results】With high or low intensity,HMGB1 was expressed in the cancenoma tissue of 20 cases（66.7%）and VEGF in the cancenoma tissue of 23 cases(76.7%)among the 30 hepatocellular carcinoma patients,the positive rates were significantly higher than those of the pericarcinous tissue(40%,46.7%)and non－cancerous tissue(P＜0.05).The expression of HMGB1 was related with VEGF(r=0.408,P＜0.05). HMGB1 also related to MVD(r=0.529,P=0.008),MVD increased when the positive rate of HMGB1 was greater than 25%.【Conclusions】HMGBl and VEGF are closely correlated in hepatocellular carcinoma. HMGB1 may be involved in angiogenesis of hepatocellular carcinoma.

high moboility group box 1 protein(HMGB1);vascular endothelial growth factor;hepatocellular carcinoma;angiogenesis;microvessel density

R735.7

A

1005-8982（2015）24-0005-04

2015-04-10

云南省教育廳科學研究基金（No：2011C088）