CS-g-PEI的均相制備及在基因治療中的應用*

陳會英，張久明，韓穎，孫丹丹，崔韶暉，趙軼男，張樹彪

[大連民族學院生命科學學院（國家民委-教育部生物資源與技術利用國家重點實驗室），遼寧 大連 116600]

·論著·

CS-g-PEI的均相制備及在基因治療中的應用*

陳會英，張久明，韓穎，孫丹丹，崔韶暉，趙軼男，張樹彪

[大連民族學院生命科學學院（國家民委-教育部生物資源與技術利用國家重點實驗室），遼寧 大連 116600]

目的采用綠色溶劑離子液體合成不同接枝率的非病毒基因載體殼聚糖接枝聚乙烯亞胺（CS-g-PEI），獲得高效低毒的殼聚糖基非病毒基因治療載體。方法以離子液體1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIM] Cl）為反應介質，羰基二咪唑（CDI）為鍵合試劑，均相合成殼聚糖（CS）接枝聚乙烯亞胺（PEI），得到不同接枝率的殼聚糖接枝聚乙烯亞胺共聚物，采用紅外光譜對接枝共聚物進行了結構表征。在人腦癌細胞（Hep-2）中采用綠色熒光蛋白（GFP-N2）和MTT法對其基因轉染性能和細胞毒性進行體外評價。結果離子液體中均相合成的CS-g-PEI具有高的基因轉染效率和低的細胞毒性。結論合成的CS-g-PEI是一種高效低毒的基因轉運載體，具有臨床應用的潛力。

基因治療；離子液體；殼聚糖；聚乙烯亞胺；接枝共聚

腫瘤已成為目前威脅人類健康和生命的頭號殺手，發病率隨著各種因素的影響正呈快速上升趨勢[1]。基因治療技術是一項生物醫學高新技術，其運用于腫瘤治療將為癌癥的臨床治療開拓一個新的空間[1-3]。基因治療的關鍵在于開發安全、高效的基因遞送載體。基因遞送載體分為病毒和非病毒載體兩

類[4]。病毒載體因在多數情況下具有較高的轉染效率被廣泛研究[5]。但目前研究和應用的病毒載體存在許多不足，如免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特異性差、制備較復雜及費用較高等，限制了其在臨床治療中的應用。非病毒基因載體因免疫原性低、安全性高、容量大和易于批量生產等優點愈來愈被重視[6-7]。天然陽離子堿性多糖殼聚糖，是天然多糖甲殼素（chitin）完全或者部分脫乙酰化的產物，具有良好的生物相容性、可降解性、低免疫原性、良好的細胞黏附能力及跨膜特性等優點，正成為非病毒基因載體的熱門研究內容之一[8-11]。然而由于殼聚糖自身水溶性較差，與其他陽離子聚合物或者陽離子脂質體相比，轉運核酸進入細胞的效率并沒有優勢。為了改進和拓寬殼聚糖在基因轉運中的應用，研究人員對殼聚糖進行了各種修飾改性[12]。但殼聚糖的高結晶性和難溶性使得許多對其改性修飾的化學反應只能在多相介質中進行。最近隨著殼聚糖溶解體系的深入研究，均相衍生化和均相接枝化的研究方法不斷出現[13]。

本研究在離子液體[BMIM]Cl為反應介質均相制備CS-g-PEI的研究工作的基礎上[14-15]，在[BMIM] Cl中制備了不同接枝率的CS-g-PEI非病毒基因載體，并采用GFP-N2質粒DNA和MTT法對其基因治療性能進行了體外評價。

1 資料與方法

1.1材料與試劑

殼聚糖（CS，Mw=40 000，脫乙酰度≥85%），國藥試劑，使用前經100℃真空干燥8 h，聚乙烯亞胺（PEI，Mw=1 800），純度99%），阿拉丁試劑有限公司，使用前在80℃真空干燥24 h，聚乙烯亞胺（PEI-25，Mw=25 000），純度99%，Sigma試劑有限公司，1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽[BMIM]Cl，按照文獻制備[16]，使用前在80℃真空干燥24 h，羰基二咪唑（CDI），分析純，北京偶聯試劑有限公司，質粒pGFP-N2和pGL3，Promega公司，細胞培養基DMEM，Invitrogen公司；熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司，人宮頸癌細胞株Hep-2，上海細胞庫。其余材料和試劑均為分析純。

1.2儀器設備

紅外光譜儀（PRESTIGE21，日本），高溫滅菌鍋（Tomy，日本），二氧化碳培養箱（NAPCO6500，法國），多功能酶標儀（伯樂680，美國），微光發光檢測儀（Synergy2，美國），凝膠成像系統（KODAK，美國），倒置熒光顯微鏡（蔡司AZIOVERT-25CFL，美國）。

1.3方法

1.3.1CS-g-PEI的均相合成在反應器中加入20 g[BMIM]Cl，置入80℃油浴中加熱熔化。加入0.5 g殼聚糖，在氮氣氣氛下攪拌，通過偏光顯微鏡觀察，攪拌至殼聚糖完全溶解。稱取適量的CDI，加入殼聚糖的[BMIM]Cl溶液中，80℃下攪拌反應2 h。再加入適量的PEI，80℃反應2 h。在反應液中加入無水乙醇，過濾，濾液旋轉蒸發去除無水乙醇后回收離子液體，濾餅轉移至透析袋中（MWCO=8 000～14 000），去離子水透析3 d，冷凍干燥，得到CS-g-PEI。固定CDI和CS的質量比為1，通過改變第2步反應中加入的PEI的量，可以控制PEI的接枝率，得到不同接枝率的CS-g-PEI。采用紅外光譜對CS-g-PEI進行結構表征。

1.3.2CS-g-PEI載體基因治療效果評價基因治療轉染效率采用GFP-N2質粒DNA和pGL3質粒DNA為報告基因，在Hep-2細胞中進行體外評價。用復凝聚的方法制備CS-g-PEI/DNA和CS/DNA納米復合物。以5×104個/孔的密度將Hep-2細胞接種到24孔板中，在37℃，5%二氧化碳條件下孵育18～24 h后至細胞融合度達到80%。轉染前2 h，將完全培養基吸去，用PBS洗滌2次，加入400μl無血清培養基和不同N/P比（質量比）的CS-g-PEI/DNA復合物（每孔含1μg DNA）孵育5 h后，將無血清培養基換成完全培養基。48 h后，在倒置熒光顯微鏡上觀測綠色熒光蛋白表達效果；在酶標儀上檢測熒光素酶表達效果，轉染效率表示為RLU/mg蛋白。

1.3.3MTT法評價細胞毒性以1×104個/孔的密度將Hep-2細胞接種到96孔板中，在37℃，5%二氧化碳條件下孵育24 h后分別加入20μl CS-g-PEI和CS溶液，以相同濃度的PEI-25作為正對照。培養24 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl，37℃繼續孵育4 h，終止培養。小心吸取孔內培養上清液后，每孔加入150μl DMSO，在37℃繼續孵育30 min。選擇570 nm波長，在SUNRISE酶標儀上測定各孔吸光值，檢測前自動混勻600 s。細胞活性的表達結果為：細胞存活率（%）=A570（sample）/A570（control）×100，其中A570（sample）為聚合物及其復合物加入的孔的吸光值，A570（control）為只含培養基的孔的吸光值。

2 結果

2.1接枝率

按照接枝率計算公式G=（W1-W0）/W0×100%，得到CS-g-PEI-1，CS-g-PEI-2和CS-g-PEI-3 3個樣品的接枝率分別為6.7%、13.5%和39.8%。G：接枝率（%），W0：殼聚糖初始質量（g），W1：接枝共聚物質量（g）。

2.2紅外表征

CS-g-PEI和CS的FTIR譜圖如圖1所示。3 380 cm-1對應于CS結構中O-H、N-H的伸縮振動峰，2 860 cm-1附近為C-H的伸縮振動峰，1 650 cm-1對應于酰胺鍵中C=O的伸縮振動峰。1 030 cm-1和1 070 cm-1對應于醇羥基的C-O伸縮振動吸收峰，而在1 140 cm-1附近為吡喃環中醚鍵伸縮振動引起的肩峰。與CS相比，CS-g-PEI1、2、3在2 860 cm-1、1 650 cm-1和1 100 cm-1附近的紅外吸收峰強度有明顯增加，分別歸屬于CS-g-PEI中PEI部分C-H伸縮振動、NHCONH中C=O伸縮振動、和C-N伸縮振動的貢獻。考慮到所用PEI的分子量為1 800，而透析袋的MWCO范圍為8 000～14 000，沒有成功共價接枝到殼聚糖骨架的PEI經透析被分離，因此圖1中歸屬為PEI部分的紅外吸收峰來自于與殼聚糖共價接枝的PEI部分的貢獻。FTIR譜圖分析結果表明，PEI與CS發生了共價接枝。隨著接枝率的不同，紅外光譜也表現出差異。

圖1 CS和CS-g-PEI的紅外光譜

圖2 GFP-N2質粒DNA在Hep-2細胞中的體外轉染效果

圖3 pGL3質粒DNA在Hep-2細胞中的體外轉染效果

圖4 CS-g-PEI的MTT細胞毒性評價

2.3載體基因治療效果評價

在Hep-2細胞中，以GFP-N2質粒DNA為報告基因，評價CS-g-PEI作為非病毒基因載體進行基因治療的體外轉染效果，CS-g-PEI和GFP-N2的N/P比為4，轉染結果如圖2所示。PEI-25是陽離子聚合物非病毒基因載體轉染效率評價的金標準，本研究以PEI-25作為正對照（N/P=4）。從圖2可以看出，未進行PEI接枝的CS在Hep-2細胞中的幾乎不表現出體外轉染，而不同接枝率CS-g-PEI均表

現出較好的轉染效率，而隨著接枝率的增加，轉染效率增高，CS-g-PEI-3的轉染效率超過PEI-25。以pGL3質粒DNA為報告基因，對CS-g-PEI的基因轉染效率進行定量評價，結果如圖3所示。從圖3可以看出，轉染效率隨著N/P的增加而增加，隨著PEI接枝率的增加而增加。當N/P比為4時，當接枝率從6.7%增加到13.5%再增加到39.8%時，轉染效率從1.2×105增加到1.7×105再增加到2.9×105，轉染效率與接枝率不構成嚴格的正比關系，而是隨接枝率增加而顯著增加。體外轉染結果表明，[BMIM]Cl中均相合成的CS-g-PEI有望成為基因治療具有應用潛力的殼聚糖基非病毒基因載體。

2.4MTT實驗結果

與PEI-25相比，CS-g-PEI均具有較低的細胞毒性，PEI-25的細胞存活率僅為22%，致死量達到78%。而CS-g-PEI的細胞存活率均在80%以上，細胞毒性比PEI-25低約4倍。該MTT細胞毒性評價結果進一步說明，[BMIM]Cl中合成的CS-g-PEI是一種生物安全的殼聚糖基非病毒基因載體，在基因治療領域具有潛在的臨床應用價值。見圖4。

3 討論

本研究在離子液體[BMIM]Cl中均相合成了不同接枝率的CS-g-PEI殼聚糖基非病毒基因載體。通過FTIR對不同接枝率的共聚物進行了結構表征。采用MTT法在Hep-2細胞系中對其基因治療性能進行了體外轉染評價；GPF-N2質粒DNA轉染效率評價結果表明，接枝率達到39.8%的CS-g-PEI-3的轉染效率超過聚合物轉染金標準PEI-25，而MTT毒性評價結果表明，CS-g-PEI的細胞致死量小于20%，其細胞毒性遠低于PEI-25。CS-g-PEI有望成為基因治療臨床應用極具潛力的殼聚糖基非病毒基因載體。

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（張蕾 編輯）

Homogeneous synthesis of CS-g-PEI and its application in gene therapy*

Hui-ying CHEN,Jiu-ming ZHANG,Ying HAN,Dan-dan SUN, Shao-hui CUI,Yi-nan ZHAO,Shu-biao ZHANG
(Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization,the National Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Dalian Nationalities University, Dalian,Liaoning 116600,P.R.China)

【Objective】To graft chitosan with various amount of low molecular weight polyethylenimine (CS-g-PEI)by ionic liquid and obtain a kind of efficient and safe chitosan based non-viral gene vectors.【Methods】CS-g-PEI copolymers with various graft ratios were homogeneously synthesized using ionic liquid 1-butyl-3-methyl imidazolium chloride[(BMIM)Cl]as the reaction solvent and 1,1-carbonyldiimidazole(CDI) as the coupling reagent.The structures were confirmed by FTIR.The transfection performance was evaluated in Hep-2 cell line in vitro.【Results】CS-g-PEI copolymers synthesized by ionic liquid[(BMIM)Cl]improved gene transfection efficiency and had low cytotoxicity.【Conclusion】The synthetic CS-g-PEI copolymers have good potential in gene therapy as non-viral gene vector candidates.

gene therapy;ionic liquid;chitosan;PEI;graft-copolymer

R945；O636.9

A

1005-8982（2015）24-0001-04

2015-03-05

國家863高新技術研究發展計劃（No：2014AA020707）；國家自然科學基金（No：21176046）；大連民族大學中央高校自主科研基金；大學生創新創業訓練計劃（No：X201403051）

張樹彪，E-mail：zsb@dlnu.edu.cn，Tel：0411-87656430