FOXO3a基因聯(lián)合干細(xì)胞修復(fù)化療對卵巢早衰的作用及分子機(jī)制

廣東省廣州市荔灣區(qū)第二人民醫(yī)院(510160)房麗紅

卵巢早衰(POF)是指女性在45歲以前出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng)4個月或以上、性器官萎縮，伴有促性腺激素包括卵泡刺激素(FSH)和黃體生成激素(LH)升高，而雌激素降低的綜合征［1］。卵泡期血液檢查不少于2次(間隔不少于30天)顯示血清卵泡刺激素(FSH)＞40 U/L、雌二醇(E2)＞73.2 pmol/L。在國外，普通人群POF發(fā)病率約為1.0%［2］，中國約3.8%，其中特發(fā)性POF約占80.0%。卵巢中干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)尤其是生殖干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為延緩衰老及POF的治療提供了良好的前景，干細(xì)胞治療在動物試驗(yàn)方面取得的成果為POF患者卵巢功能及生育能力的恢復(fù)帶來了希望。Forkhead Box(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。這些基因表達(dá)的改變與動物的生長發(fā)育、免疫調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，它的突變也可引起卵巢生理功能的改變、POF和卵巢腫瘤的發(fā)生。干細(xì)胞DNA修復(fù)與FOXO3a通路密切相關(guān)。FOXO3a可促進(jìn)干細(xì)胞的增值即有助于維持干細(xì)胞的功能［3-4］。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床標(biāo)本 93例標(biāo)本取自我院2012年10月至2014年3月，婦科POF干細(xì)胞修復(fù)化療患者93例，其中青年組(＜25歲)63例;中年組(35～45歲)30例。所有患者無慢性疾病史。

1.1.2 試劑 PCR試劑盒(Invitrogen)公司，RevertAidTM First strand cDNAsynthesis Kit Fermentas公司，Trizol試劑(Invitrogen)公司，SYBR Green PCR premix大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 所有用品均嚴(yán)格按消除RNase的常規(guī)方法處理，玻璃及金屬器皿在250℃烘烤4小時，塑料器皿用DEPC溶液浸泡24小時，高壓滅活DEPC后烤干備用。將患者卵巢組織從液氮中取出，在無菌的研缽中加液氮進(jìn)行研磨成粉末狀，放入加有1mLTrizol的Ep管(每100 mg組織)，4℃離心，12000rmp/min，5分鐘，留上清，每管加入200μL異丙醇以抽提蛋白，4℃離心，12000 rmp/min，15分鐘，棄上清，每管加1mL無水乙醇，離心10分鐘，每管加3～40μL DEPC水，混勻，測RNA濃度。各樣本OD260/OD280比值均在1.8～2.0，說明提取的RNA較純。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)RNA為cDNA。具體操作步驟同說明書。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 從GeneBank中檢索小鼠FoxO3a和β-actin基因引物序列，在線Genbank查找目的基因FoxO3a和β-actin cDNA序列，應(yīng)用DNA MAN軟件設(shè)計(jì)引物，引物的詳細(xì)資料見表1，引物由上海生工生物公司合成。2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA2μL，上游引物0.3μL(10μM，下游引物0.3μL(10μM)，ddH2O 7.4μL，總體積20μL。標(biāo)準(zhǔn)品，分別以10為系數(shù)進(jìn)行倍比稀釋，分別制備目的基因和內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系:FOXO3a進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95℃30秒鐘，95℃15秒鐘，60℃30秒鐘，β-actin進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù)為預(yù)變性95℃30秒鐘，95℃15秒鐘，58℃30秒鐘，熒光檢測，反應(yīng)45個循環(huán)，每個樣設(shè)3個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法，確定特定熒光域值對應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值，對目標(biāo)基因定量。

表1 定量RT-PCR所用的基因引物

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以()表示，采用單因素方差分析和多重比較對各組進(jìn)行比較分析，以P＜0.05差異有顯著性。

2 結(jié)果

POF患者卵巢組織FOXO3amRNA的表達(dá)變化實(shí)時熒光定量結(jié)果顯示，組間比較，中年組FoxRNA高于表年組。組內(nèi)比較治療后青年組中器質(zhì)性病變的患者與功能性病變的患者卵巢中FOXO3a mRNA均明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.05)，其中器質(zhì)性病變FOXO3a mRNA水平低于功能性病變的患者。

3 討論

POF主要分為器質(zhì)性病變和功能性病變，器質(zhì)性病變涉及腫瘤發(fā)生等改變，遺傳基因改變是皮膚自然衰老的根本，有研究表明，F(xiàn)OXO3a基因能抑制卵泡活化，防止POF［5-8］。

如果用于治療的胚胎干細(xì)胞具有其特有的多能性和全能性，胚胎干細(xì)胞無論對轉(zhuǎn)基因動物的制備還是對疾病的治療都具有巨大的潛能，胚胎干細(xì)胞具有其他細(xì)胞不可比擬的特性使胚胎干細(xì)胞應(yīng)用廣泛，要合理控制胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)和體外的分化，關(guān)鍵要了解那些控制胚胎干細(xì)胞命運(yùn)的基因［9-10］。FOXO3a在胚胎發(fā)育和維持胚胎干細(xì)胞多能性都具有重要作用。FOXO3a是FOX家族中的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它對胚胎上胚層及其衍生物的形成和建立多潛能胚胎干細(xì)胞系具有重要作用，并與控制胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞多能性的其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有一定的相關(guān)性。FOXO3a是維持胚胎上胚層細(xì)胞多潛能性和在體外建立胚胎干細(xì)胞系所必需的［11］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a隨年齡的增加表達(dá)量明顯增多FOXO3a作為卵泡活化分子之一，起了很重要的調(diào)節(jié)作用。實(shí)時熒光定量結(jié)果顯示，組間比較，中年組FOXO3a高于青年組。組內(nèi)比較，治療后器質(zhì)性病變的患者與功能性病變的患者卵巢中FOXO3a mRNA均明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.05)，其中器質(zhì)性病變FOXO3a mRNA水平低于功能性病變的患者，與治療后比較差異更顯著(P＜0.01)。提示FOXO3a為POF的可能的治療靶點(diǎn)，F(xiàn)OXO3a基因聯(lián)合干細(xì)胞修復(fù)化療可促進(jìn)POF的痊愈，同時年齡相對小的患者療效會好于年齡偏大的患者，器質(zhì)性病變的患者應(yīng)用FOXO3a基因治療輔助激素調(diào)節(jié)將將大大促進(jìn)POF的治愈。本研究為POF的基因治療提供了新的靶點(diǎn)和重要參考。

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