慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂體腺瘤細胞生長的體外實驗研究的護理方式

廣東省從化市婦幼保健院(510900)羅巧靈

大型生長激素(PRL)型垂體腺瘤是一種較為常見的激素分泌性垂體瘤［1］，在此類型中所占的比重約為35%～45%［2］，PRL垂體腺瘤種類中的侵襲性腺瘤具有全切率低、復發率高的特點［3］，成為臨床治療的難點。但是經過醫療科學人員的不懈努力，終于研制出了對抗PRL垂體腺瘤的方式，但是在目前醫療技術水平條件的制約下，手術、放療、藥物等治療措施仍很難將其徹底根治。經過體外實驗研究表明，垂體腫瘤細胞轉化基因(PTTG)成為了垂體腺瘤靶向治療的重要基因之一，近年來成為垂體腺瘤基礎研究的熱點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂體腺瘤細胞生長的體外實驗需要的材料有:培養基、FBS［4］、瓊脂糖、綠色熒光蛋白重組載體、pHelper3.0包裝系統、LV-NC病毒載體、兔抗鼠PTTG抗體、羊抗兔IgG、預染蛋白、PVDF膜、顯色劑、MTT、1.5mlEP管，20～250μL移液器。其中FBS胎牛血清、瓊脂糖、羊抗兔IgG、預染蛋白、PVDF膜、顯色劑均為國外進口。

1.2 原代培養源 原代培養源主要由從化的1位PRL型垂體腺腫瘤的患者提供，男，年齡42歲，通過手術切除腫瘤標本。對得到的腫瘤標本按照規定進行原代培養試驗。

1.3 PTTG-shRNA慢病毒載體的構建 利用short interfering RNA設計工具軟件進行設計，合并具有shRNA結構的短發夾序列。干擾序列為5'-aaTACACCTAGTTAACCGACTTGCCAtt-3'，寡核苷酸序列有:1)正義鏈為5'-CCGAAGTTGAATAGCCTCAGCAGAGCGATCGAGCTTTT-3'。2)反義鏈為5'-AATGACTAAAATGCGTACATAAGTCGAGTACGCTTAGC AG-3'。

正義鏈與反義鏈中均含有酶切位點，形成雙鏈DNA，與酶結合、轉化鏈接，生成pGCSIL-GFD重組載體，聯合pHelper3.0質粒后共傳染了300T細胞，產生PTTG-shRNA慢病毒載體，病毒載體滴度為4×109TU/mL。

1.4 實驗分組以及慢病毒傳染的情況 傳染前1天將細胞接種在孔板上，分為正常對照組、陰性對照組和觀察組。正常對照組不進行任何處理，對陰性對照組進行慢病毒載體傳染，觀察組進行PTTG-shRNA進行傳染。

2 結果

2.1 PTTG-shRNA慢病毒感染的效果 經過慢病毒感染后的細胞在5小時后有綠色熒光現象產生，71小時后更換培養液，繼續進行為期2天的培養，流式細胞儀分析后，3組腫瘤細胞的表達率均符合實驗的需求。

2.2 3組PTTG基因表達情況 觀察組PTTG基因表達為(0.27±0.03)，正常對照組PTTG基因表達為(0.94±0.04)，陰性對照組PTTG基因表達為(0.96±0.06)，基因表達量明顯下降，P＜0.05，差異具有顯著性。

2.3 3組PTTG蛋白表達情況 觀察組PTTG蛋白的表達量為(0.13±0.04)，正常對照組PTTG蛋白的表達量為(0.94±0.06)，陰性對照組PTTG蛋白的表達量為(0.87±0.06)。

2.4 3組傳染后細胞生長情況比較 傳染71小時后，觀察組細胞的生長發育能力、轉移擴散能力明顯降低，比其他兩組抑制細胞生長的能力更強，并且再經24小時后繼續觀察發現，此結論表現的更為明顯。陰性對照組與正常對照組則沒有發生癌細胞生長方面情況的變化。

2.5 3組細胞凋亡需要的周期 觀察組的垂體腫瘤細胞G0/G1時期細胞凋亡的情況明顯，但是在S時期出現降低的現象，從總體上來說給垂體腫瘤患者帶來了福音。

2.6 提供垂體腺腫瘤的患者護理情況 從化市提供垂體腺腫瘤的患者經過精心護理后病情得到了較大的好轉。術后對患者提供的護理服務有:1)蘇醒后的護理方式。在患者蘇醒6個小時后需要給床海拔16頭，防止靜脈回流造成腦部水腫。2)膨脹海綿塞住患者的口腔。在手術24小時后對患者進行鼻腔護理和口腔護理，患者沒有發生感染的情況。3)并發癥的護理。對于手術后患者高熱的不良反應，本次護理中給患者使用了冬眠藥物，有效地避免了意識障礙情況的發生。

3 討論

PTTG是近年來發現的一種新型的原癌基因，在垂體腺瘤靶向治療中具有極大的潛在價值。從關于人PRL型垂體腺瘤的相關研究中發現，PPTG是一種能夠促進癌癥細胞生長、擴散，提高吞噬能力的癌癥基因［6］，能夠使腫瘤周邊產生新的血管，加快腫瘤細胞的繁殖速度。裸鼠試驗證明，在沒有其他癌癥基因的前提下，PTTG也能夠導致裸鼠快速致癌［7］。

通過本次實驗發現，PTTG基因的突變能夠消除其對正常細胞的惡性影響［8］，具有抑制人PRL型垂體腺瘤細胞擴散的作用，成為生物治療重點研究的課題，是當今醫學界最為熱門的靶點之一［9］。

本次研究中，利用了shRNA技術進行干擾，下調PTTG基因中蛋白的表達，設立正常對照組和陰性對照組，觀察經過干預后癌細胞增殖和凋亡的情況，系統地分析慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂體腺瘤細胞生長的作用。結果表明，PTTG病毒載體對垂體細胞的傳染可高達97%以上，且觀察組PPTGmRNA表達比正常對照組和陰性對照組更趨于正常狀況，下降較為明顯。另外，觀察組腫瘤細胞的生長能力出現滑坡的趨勢，對垂體腫瘤細胞的抑制效果更為明顯，凋亡率顯著提高。但是，PPTG誘導腫瘤細胞死亡的原理目前并不是非常明確，需要進一步進行求證。

由實際病例的護理方式得到了良好的效果和上述實驗中的啟示，可以得知在護理中需要注重的問題。1)嚴密檢測病情的發展情況。密切注重PTTG蛋白表達情況，發現異常情況立刻采取相關的措施控制病情。2)在做好基本護理的同時需要對患者進行心理疏導。在患者得知自己的病情經過手術、放療、藥物等治療措施仍很難將其徹底根治這一基本情況時，會產生恐懼、憂慮的心理，因此需要對患者進行心理干預，減少不良的心理狀態對患者的影響，幫助患者用積極的心態迎接病魔的挑戰。

綜上所述，慢病毒介導的shRNA沉默PTTG能夠抑制人PRL型垂體腺瘤細胞的生長，消除PTTG基因的惡性影響［10］，抑制癌細胞的擴散，降低PPTGmRNA和蛋白表達水平，提高癌癥細胞的凋亡率，為垂體腺瘤的生物治療探索有效的治療途徑，具有極強的醫學價值，值得推廣。

［1］沈云龍，崔玉婷，朱劍峰，等.慢病毒介導的shRNA沉默PTTG基因表達對人生長激素型垂體腺瘤細胞生長的影響［J］.中國微侵襲神經外科雜志，2012，8:376

［2］沈云龍，崔玉婷，朱建峰，等.PTTG基因siRNA載體的構建與鑒定［J］.解剖學研究，2012，4:280

［3］范勝強.RNAi沉默PTTG對大鼠垂體腺瘤細胞CD147、MMP-9表達的影響［D］.山東大學，2012

［4］曹中喆.PI3K/Akt/mTOR及其下游通路在PRL垂體腺瘤中的表達及意義［D］.河北醫科大學，2013

［5］蔡鋒.TGFβ1/Smad-SDF-1α/CXCR4在成纖維細胞-垂體腺瘤細胞相互作用中的機制研究［D］.北京協和醫學院，2013

［6］莫小亮.HPV16E6和hTERT在宮頸癌致癌機制中的作用研究［D］.廣西醫科大學，2014

［7］孫帥奇.100例垂體腺瘤患者的臨床回顧分析［D］.桂林醫學院，2013

［8］李妍，杜紅延，李紅衛.慢病毒載體及其在RNA干擾技術中的應用與發展［J］.分子診斷與治療雜志，2013，1:55

［9］陳其鉆，陳謙學.垂體腺瘤治療現狀和進展［J］.中國臨床神經外科雜志，2013，6:381

［10］彭冬先，何援利，丘立文.慢病毒介導靶向survivin基因的shRNA對裸鼠子宮內膜異位病灶生長的影響［J］.現代婦產科進展，2013，9:704