小菜蛾對溴蟲腈抗性篩選、風險評估及交互抗性研究

賈變桃，洪珊珊，王 龍

(山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)是一種重要的十字花科蔬菜害蟲。其繁殖力強，世代重疊嚴重，具有很強的適應(yīng)性，屬于典型的r-對策害蟲;同時小菜蛾具有遠距離遷飛能力，在不同地區(qū)之間可以相互擴散，給蔬菜生產(chǎn)造成嚴重危害(Talekar and Shelton，1993)。一直以來，化學農(nóng)藥是防治小菜蛾的主要手段。長期的藥劑防治使小菜蛾對各類殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，這些藥劑包括有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、昆蟲生長調(diào)節(jié)劑、蘇云金桿菌以及抗生素類殺蟲劑阿維菌素和多殺菌素等(Tabashnik et al.，1990;閆艷春等，1997;馮夏等，2001;陸劍飛等;2004;趙峰等，2006)，甚至對新型殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺也監(jiān)測到了極高水平抗性(胡珍娣等，2012)。

溴蟲腈是美國氰胺公司1988年由天然抗生素經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后開發(fā)的具有獨特作用機理的殺蟲殺螨劑，作為一種殺蟲劑前體，其本身并無殺蟲作用，在昆蟲體內(nèi)經(jīng)多功能氧化酶作用，脫去N-乙氧基乙基轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N氧化磷酸化解偶聯(lián)劑，作用于蟲體細胞內(nèi)線粒體，干擾質(zhì)子濃度，使其透過線粒體膜受阻，從而影響ATP 的生成，破壞細胞，最終導致害蟲死亡(徐尚成和蔣木庚，2003;歐曉明等，2003)。溴蟲腈高效廣譜，已進入我國市場，登記用于蔬菜害蟲的防治，也是農(nóng)業(yè)部推薦的高毒農(nóng)藥的重要替代品種之一。據(jù)黃超燕等(2005)報道，10%溴蟲腈懸浮劑1000 倍液可有效控制小菜蛾的為害。隨著溴蟲腈的大面積推廣應(yīng)用，小菜蛾勢必對其產(chǎn)生抗藥性。我國浙江(柴偉剛等，2010)、湖南(符偉等，2012)和廣東(周麗娟等，2011)等地區(qū)，已監(jiān)測到小菜蛾對溴蟲腈產(chǎn)生低到中等水平抗性。目前還未見國內(nèi)外小菜蛾對溴蟲腈室內(nèi)抗性選育的報道。本研究在室內(nèi)進行小菜蛾對溴蟲腈的抗藥性篩選，評估其抗藥性風險，進一步測定了小菜蛾對溴蟲腈產(chǎn)生抗性后對其他殺蟲劑的交互抗性，為合理使用該殺蟲劑以及小菜蛾的抗性綜合治理提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

小菜蛾幼蟲于2010年秋采自太谷縣郊區(qū)甘藍田，帶回室內(nèi)進行飼養(yǎng)，一部分在室內(nèi)不接觸任何藥劑的條件下，飼養(yǎng)3年以上作為對照種群;另一部分用溴蟲腈進行抗性篩選。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(25±1)℃，相對濕度70%左右，光周期為14L∶10D。

1.2 供試藥劑

100 g/L 除盡懸浮劑(有效成分:溴蟲腈，德國巴斯夫公司);150 g/L 安打懸浮劑(有效成分:茚蟲威，美國杜邦公司);5%美除乳油(有效成分:虱螨脲，瑞士先正達公司);1.8%愛諾蟲清乳油(有效成分:阿維菌素，華北制藥集團愛諾有限公司);50%丁醚脲懸浮劑(標正作物科學有限公司);25 g/L 菜喜懸浮劑(有效成分:多殺菌素，美國陶氏益農(nóng)公司);200 g/L 康寬懸浮劑(有效成分:氯蟲苯甲酰胺，美國杜邦公司)。

1.3 生物測定方法

采用浸葉法。取未接觸農(nóng)藥的新鮮甘藍葉片，剪成大小一致，浸入系列濃度藥液中20 s，以清水(含0.02%的Triton X-100)作為對照。處理葉片在室溫下晾干后放入直徑為6.5 cm 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部用濕濾紙保濕。每培養(yǎng)皿放1 張?zhí)幚砣~片，接大小一致的3 齡幼蟲10 頭。每處理重復3 到4 次。試驗條件:溫度(25±1)℃，濕度70%左右，光周期為14L∶10D。溴蟲腈和多殺菌素處理48 h，茚蟲威、虱螨脲、丁醚脲、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺處理72 h 后檢查結(jié)果。試蟲死亡判定標準為:蟲體變黑，或用鑷子觸碰蟲體無反應(yīng)，或蟲體已嚴重變形，行動不正常者。用POLO 軟件計算毒力回歸方程的斜率(slope)、標準誤、LC50及其95%置信限。

1.4 抗性篩選方法

根據(jù)每代測定的毒力數(shù)據(jù)，以LC30劑量進行篩選(F1代篩選劑量為LC15)。篩選方法同1.3。每代篩選試蟲數(shù)至少600 頭。48 h 后更換新鮮葉片并統(tǒng)計死亡率，直至化蛹。

1.5 估算現(xiàn)實遺傳力及預測抗性發(fā)展速率

根據(jù)Tabashnik ＆ McGaughey(1994)改進的分析方法估算現(xiàn)實遺傳力h2=R/S。選擇反應(yīng)R=(篩選n 代LC50的對數(shù)值-篩選前親代LC50的對數(shù)值)/n;選擇差異S=iδp，其中選擇強度i=1.583-0.0193336 P+0.0000428 P2+3.65194/P(10＜P＜80)(P=100-平均校正死亡率)，表現(xiàn)型標準差δp 為篩選各代毒力回歸線的斜率的平均值的倒數(shù)。

根據(jù)現(xiàn)實遺傳力h2，可以預測篩選后抗性上升x 倍所需代數(shù)［Gx=lgx/(h2S)］，以及不同選擇壓力(50%-99%)下，抗性上升10 倍所需的代數(shù)［G=R-1=1/(h2S)］。

1.6 交互抗性的測定

分別測定未篩對照種群和篩選種群對多殺菌素、茚蟲威、虱螨脲、丁醚脲、阿維菌素和氯蟲苯甲酰胺這6種殺蟲劑的毒力(方法同1.3)，以確定小菜蛾對溴蟲腈產(chǎn)生抗性后，是否對上述藥劑具有交互抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴蟲腈對小菜蛾的室內(nèi)抗性篩選

用溴蟲腈對采自太谷郊區(qū)的小菜蛾田間種群進行抗性篩選，飼養(yǎng)20 代期間共篩選18 代，LC50由篩選前的5.201 mg/L 上升到20 代時的250.673 mg/L，抗性增長48.2 倍，達到了高水平抗性。其中，F(xiàn)0-F14期間，共篩選11 代，抗性持續(xù)增長，飼養(yǎng)到14 代時，與起始種群相比為41.5倍，達到了高水平抗性。但由于抗性還不穩(wěn)定，以后幾代篩選抗性有所下降，但都保持在中等水平，到20 代時，抗性倍數(shù)為48.2，再次達到了高水平抗性(表1)。

表1 溴蟲腈對小菜蛾太谷種群的抗性篩選Table 1 Resistance selection of Plutella xylostella to chlorfenapyr(Taigu，Shanxi Province)

2.2 小菜蛾對溴蟲腈的抗性風險評估

計算了不同篩選階段的抗性現(xiàn)實遺傳力。飼養(yǎng)20 代，實際篩選18 代，抗性現(xiàn)實遺傳力h2=0.465。前9 代篩選的現(xiàn)實遺傳力(h2=0.563)遠遠大于后9 代篩選的現(xiàn)實遺傳力(h2=0.078)。這表明由于加性遺傳方差導致的抗性表現(xiàn)型方差的比例在篩選過程中下降(表2)。

表2 小菜蛾對溴蟲腈的抗性現(xiàn)實遺傳力Table 2 Realized heritability of resistance to chlorfenapyr in Plutella xylostella

由于室內(nèi)的篩選環(huán)境比田間相對穩(wěn)定，環(huán)境方差要小于田間，因此估算的h2可能比田間的實際值偏高。假設(shè)現(xiàn)實遺傳力h2為室內(nèi)篩選的估算值的一半，可能更接近于田間實際。假設(shè)溴蟲腈對小菜蛾的致死率為50%、60%、70%、80%、90%和99%，現(xiàn)實遺傳力為室內(nèi)估算值的一半時，對抗性提高10 倍所需的代數(shù)進行了預測(假設(shè)篩選前后毒力回歸線的斜率為2.7，即δp=0.370，該假設(shè)斜率接近于室內(nèi)篩選過程中的平均斜率)。從圖1 可以看出，小菜蛾的抗藥性發(fā)展速率隨藥劑選擇壓的升高而加快。在溴蟲腈控制的選擇壓為80%-90%時，預計小菜蛾對溴蟲腈抗性增加10 倍，需要6.6-8.3 代。

圖1 溴蟲腈不同選擇壓力對抗性發(fā)展速率的影響(斜率2.7，δp=0.370)Fig.1 Effect of selection pressure caused by chlorfenapyr on resistance developmental rate(slope 2.7，δp=0.370)

2.3 抗溴蟲腈小菜蛾品系的交互抗性研究

當溴蟲腈篩選小菜蛾18 代時，測定了該篩選種群對阿維菌素、虱螨脲、氯蟲苯甲酰胺、多殺菌素、茚蟲威和丁醚脲的敏感性。結(jié)果表明:溴蟲腈篩選種群對阿維菌素、虱螨脲、氯蟲苯甲酰胺、多殺菌素和茚蟲威抗性倍數(shù)分別為1.6、1.2、1.5、1.1 和0.8，均無交互抗性;對丁醚脲的抗性倍數(shù)為3.4，篩選和未篩選種群95%置信限沒有交叉，說明有顯著差異，但是否具有交互抗性還有待于進一步研究證實(表3)。

3 結(jié)論與討論

研究表明，害蟲如果長期處于低劑量藥劑的選擇壓力下，敏感個體不斷被淘汰，抗藥性個體逐代存活下來，有利于種群抗藥性的積累和發(fā)展。高宗仁等(1991)用低劑量溴氰菊醋、氧化樂果、殺蟲脒和三氯殺螨醇對朱砂葉螨連續(xù)選擇3 代后，其對這4種藥劑敏感性分別降低了6.23、1.16、1.23 和2.24 倍。李瑞娟等(2005)用梅嶺霉素和溴蟲腈連續(xù)處理二斑葉螨10 代，對梅嶺霉素抗性增長9.2 倍，對溴蟲腈抗性增長10.0 倍。龔佑輝等(2010)用多殺菌素LC25劑量對西花薊馬連續(xù)處理47 代后，其敏感性下降了6.72 倍。本研究中，用溴蟲腈LC30處理小菜蛾18 代，小菜蛾對溴蟲腈敏感性下降了48.2 倍，產(chǎn)生了高水平抗性。說明在長期低劑量的選擇壓下，小菜蛾具有對溴蟲腈產(chǎn)生高抗性的風險。

表3 溴蟲腈篩選小菜蛾對其他殺蟲劑的交互抗性Table 3 Cross-resistance of chlorfenapyr-selected Plutella xylostella to other insecticides

抗性發(fā)展速率除了與選擇壓有關(guān)外，還與種群的抗性等位基因頻率有關(guān)。已知現(xiàn)實遺傳力是加性遺傳方差與表現(xiàn)型方差的比率，而加性遺傳方差是相應(yīng)抗性等位基因頻率的函數(shù)，當抗性基因頻率處于中等水平時加性遺傳方差和h2最高，當抗性等位基因頻率接近于0 或100% 時，h2最低，趨近于0(Falconer，1989)。從表2 可以看出，18 代篩選期間，前半段篩選現(xiàn)實遺傳力(h2=0.563)遠大于后半段篩選的現(xiàn)實遺傳力(h2=0.078)，這與小菜蛾、煙蚜夜蛾和馬鈴薯甲蟲對Bt 的前半段和后半段篩選的抗性現(xiàn)實遺傳力情況一致(Tabashnik，1992)，也類似于小菜蛾對丁烯氟蟲腈前半段和后半段的抗性現(xiàn)實遺傳力(牛洪濤等，2008)。這說明小菜蛾田間種群存在抗性基因，由遺傳變異而使抗性表現(xiàn)型在下代可實現(xiàn)的比例h2較大，抗性發(fā)展較快，但隨著篩選的進行，敏感基因逐步被淘汰，抗性基因在種群中逐漸趨于穩(wěn)定，遺傳變異在抗性表現(xiàn)型中所占比例下降，抗性發(fā)展減慢，h2減小。

應(yīng)用閾性狀分析法，估算得小菜蛾對溴蟲腈的抗性現(xiàn)實遺傳力為0.465，大于小菜蛾對Bt(Tabashnik，1992)、阿維菌素(梁延坡等，2010)和丁烯氟蟲腈(牛洪濤等，2008)的抗性現(xiàn)實遺傳力，說明小菜蛾對溴蟲腈產(chǎn)生抗性的風險要高于這3種藥劑。由于在室內(nèi)選擇環(huán)境固定，環(huán)境方差的變化小于田間，這樣導致室內(nèi)估算的h2可能比田間的實際值偏高，因此，我們在進行抗性發(fā)展速率預測時，假定h2為室內(nèi)實際估算值的一半。此時，當溴蟲腈選擇壓為80%-90%時，預計小菜蛾抗性增加10 倍，僅需要6.6-8.3 代。這表明小菜蛾對溴蟲腈抗性風險較高。

交互抗性測定結(jié)果表明，小菜蛾對溴蟲腈產(chǎn)生48.2 倍高水平抗性后，對阿維菌素、虱螨脲、氯蟲苯甲酰胺、多殺菌素和茚蟲威不表現(xiàn)交互抗性;但對丁醚脲的抗性倍數(shù)為3.4，表現(xiàn)為敏感性下降。這兩種藥劑都作用于線粒體，影響呼吸作用及能量轉(zhuǎn)換，且都與多功能氧化酶有關(guān)，因此，它們之間具有交互抗性是可能的。但二者交互抗性處于何種水平，需要繼續(xù)篩選，待抗性提高到一定程度后作進一步研究。

雖然室內(nèi)篩選結(jié)果不能直接應(yīng)用于田間，但仍提供了抗性產(chǎn)生的明確證據(jù)，為預防性抗性治理措施的制定提供了重要參考。根據(jù)以上研究結(jié)果，建議田間防治小菜蛾時應(yīng)盡可能限制溴蟲腈的使用次數(shù)，同時注意與其他不具交互抗性的殺蟲劑之間的交替輪換使用，降低選擇壓，以延緩抗藥性的產(chǎn)生。

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