極地與深海生境鏈霉菌產生的吲哚咔唑生物堿殺蟲活性及作用機理初探

王 可，張久明，史振平，田 黎*

(1.青島科技大學，青島266042，2.國家海洋局第一海洋研究所，青島 266061)

隨著人們對環境保護重要性認識的日益加深，對低毒高效綠色農藥的要求更為嚴格，同時，害蟲的抗藥性增加與新害蟲的出現，也增加了農業生產對新農藥的不斷需求，與生物殺菌劑相比，高效低毒的殺蟲劑的開發更為困難，農藥創制最主要的研究內容是先導化合物的發現，而其作用機理也是農藥研究的重要組成部分。海洋微生物作為新農藥先導化合物發現的資源正逐漸受到重視，深海與極地是海洋環境的特殊生境，在此生境生活的微生物被認為更容易產生有用的代謝產物(李利君等，2000)。課題組從北冰洋深海區沉積物中分離獲到一株鏈霉菌 Streptomyces nitrosporeus，并由其代謝產物中獲得一種吲哚咔唑類生物堿，此類化合物多用于抗腫瘤藥物研制，很少用于殺蟲劑的研究(Sanchezl and Insuamm，2003;侯琦，2008;陳蘇婷和尤啟冬，2008)。本研究測試了吲哚咔唑類生物堿對菜青蟲Pieris rapae、小菜蛾 Plutella xyllostella、甘藍蚜 Brevicoryne brassicae 和美國白蛾Hyphantria cunea 等多種害蟲的殺蟲活性，并以菜青蟲為靶標試蟲，對此化合物的作用機理進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及產生的吲哚咔唑生物堿

硝孢鏈霉菌Streptomyces nitrosporeus 菌株由課題組從北冰洋深海區沉積物中分離獲得，其生境同時具備極地與深海的特性，采用海洋放線菌培養基培養12 d，發酵物經殺蟲活性跟蹤提取，獲得吲哚咔唑生物堿，測試前先以1%的甲醇溶解成母液，再用蒸餾水配置成相應的測試濃度。

1.2 測試害蟲及試驗方法

菜青蟲、甘藍蚜、美國白蛾和小菜蛾均采自青島科技大學生物農藥試驗基地甘藍田，在溫室內連續飼養3 代以上。飼養條件:溫度25℃±1℃，RH60%-70%，光周期14L∶10D。選擇個體發育一致的健康3 齡幼蟲供試。

1.2.1 胃毒活性測定:采用浸葉飼喂法測定(徐向榮等，2006)。甘藍葉蝶浸入0.08 mg/mL 藥液5 s，取出晾干，放入墊有保濕濾紙的培養皿中，接入供試昆蟲，每皿20 頭蟲，重復3 次，同樣濃度甲醇處理為對照。48 h 后檢查死亡蟲數，計算校正死亡率。

1.2.2 觸殺活性測定:采用微量點滴法測定(徐向榮等，2006)。將幼蟲浸入0.08 mg/mL 藥液7 s，濾紙吸去蟲體多余藥液，置裝有干凈濾紙與甘藍葉的培養皿，每皿20 頭，重復3 次，同樣濃度甲醇處理為對照，48 h 后檢查死亡蟲數，計算校正死亡率。

1.2.3 生長發育測定方法:以不同濃度吲哚咔唑生物堿(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL)處理的甘藍葉片飼喂菜青蟲3 齡幼蟲，試蟲處理前饑餓5-6 h。每處理3個重復，每重復10 頭幼蟲，對照以溶劑處理飼喂，2 d 后換以新鮮無毒葉片繼續飼喂。觀察試蟲生長發育情況，記錄試蟲蛹重和化蛹率，每24 h 稱重1 次，記錄試蟲體重，并計算生長發育抑制率，計算公式如下:

1.2.4 酚氧化酶活性測定:(1)試蟲處理方法:取菜青蟲3 齡初期幼蟲，饑餓5 h 后，分對照和處理兩組各20 頭待試。處理組試蟲以0.04 mg/mL藥劑浸漬的甘藍葉片飼喂，對照組飼喂溶劑浸漬的葉片。分別取飼喂后24 h、48 h、72 h 的試蟲待試。(2)將處理好的試蟲經磷酸緩沖液清洗后整體置于預冷的勻漿器中，定量加入0.02 mol/L pH 6.5磷酸緩沖液。冰浴下勻漿，6000 r/min、4℃離心30 min。用移液槍吸取上清液為待測酶液。酶活性測定參考Benjamin and Montgomery 的方法(1973)。

1.2.5 纖維素酶活性測定:試蟲處理方法同1.2.3。酶活性測定參照潘魯青和王克行的方法(1997)。

1.2.6 幾丁質酶活性測定:試蟲處理方法同上。酶活性測定參照張少英方法(2005)。

1.2.7 酯酶活性測定:試蟲處理方法同1.2.3。酶活性測定參照劉剛方法(2007)。

1.2.8 酶原蛋白含量測定:參考Bradford 考馬斯亮藍G-250 法(1976)。

2 結果與分析

2.1 吲哚咔唑生物堿對4種試蟲的殺蟲活性

吲哚咔唑生物堿對菜青蟲、小菜蛾、甘藍蚜和美國白蛾的活性結果見圖1。由圖1 可以看出，供試的4種試蟲中，小菜蛾受到的影響最大，觸殺和胃毒處理的校正死亡率分別達到了96.55%和86.21%，對菜青蟲的觸殺活性為89.66%、胃毒活性為81.04%，對美國白蛾的觸殺活性為82.76%、胃毒活性為74.14%，對甘藍蚜的觸殺活性為79.31%、胃毒活性為60.35%。結果表明，哚咔唑生物堿對多種害蟲同時具有很強的觸殺和胃毒活性，觸殺活性略高于胃毒。

圖1 吲哚咔唑生物堿化合物4種試蟲的殺蟲活性Fig.1 Insecticidal activities of Indolocarbazole alkaloid to 4 kinds of insects

2.2 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲生長發育的影響

吲哚咔唑生物堿對菜青蟲幼蟲生長的抑制率如圖2。0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL不同濃度藥劑處理后，第1 天不同濃度的藥劑處理對試蟲的生長影響與對照相比無顯著性差異(P＞0.05)，之后抑制率開始升高，而且不同濃度對試蟲的生長抑制作用存在極顯著差異(P＜0.01)，3種濃度分別在處理后的第3 天、第2 天和第4 天達到最大，為12.95%、16.49%和33.47%。以上結果說明吲哚咔唑生物堿能對菜青蟲的生長發育起到較好的抑制作用，而且隨著藥劑濃度的升高，最大抑制作用增強。

圖2 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲的生長發育抑制率Fig.2 Inhibition ratio of Indolocarbazole alkaloid against Pieris rapae

吲哚咔唑生物堿對菜青蟲蛹重和化蛹率的影響結果見表1。由表中數據可知，三組不同濃度的藥劑處理的試蟲中，0.08 mg/mL 藥劑處理的試蟲蛹重最低為31.8 mg，化蛹率僅為37.67%;0.02 mg/mL 處理的試蟲蛹重和化蛹率最高，這表明吲哚咔唑生物堿對菜青蟲蛹重的增加和化蛹率起到了較好的抑制作用，而且濃度越高抑制作用越明顯。

表1 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲蛹重和化蛹率的影響Table 1 Inhibitory effect on weight of pupa and pupation rate of Indolocarbazole alkaloid against Pieris rapae

2.3 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲酚氧化酶活性的影響

菜青蟲酚氧化酶活性受吲哚咔唑生物堿的影響結果見表2，處理24 h 之前，酚氧化酶活性幾乎不受影響，隨著時間的延長，對酶的抑制作用增強，到48 h 對照組酶活為1.2941 △OD/min·mg pr，處理組酶活僅為0.5974 △OD/min·mg pr，兩者差異顯著，活性抑制也達到最大。表2 顯示處理24 h、48 h 和72 h 后，酶比活力分別表現為同期對照的0.73、0.46 和0.53 倍，表明吲哚咔唑生物堿對菜青蟲酚氧化酶有明顯的抑制作用。

表2 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲3 齡幼蟲酶活的影響Table 2 Effect of Indolocarbazole alkaloid on enzyme activity in the 3rd instar larvae of Pieris rapae

2.4 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲纖維素酶活性的影響

由表2 可以看出，菜青蟲纖維素酶活性受吲哚咔唑生物堿的影響，各時期酶活性大多低于相應對照的酶活性，48 h 對照組酶活性為0.7100 μg/min/mg，處理組酶活性僅為0.3710 μg/min/mg，即化合物處理試蟲24 h、48 h 和72 h，酶比活力分別是同期對照的0.73、0.52 和1.07 倍，表現為先抑制后升高。

2.5 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲幾丁質酶活性的影響

由表2 可知，經生物堿處理的菜青蟲幾丁質酶呈現在24 h 活性達到最大為1.3450 OD/mg pr，而對照組的酶活性為0.7820 OD/mg pr，處理是對照的1.72 倍，48 h 后處理組酶活開始下降，為同期對照的0.87 倍，但下降幅度不大，72 h 為0.85 倍。

2.6 吲哚咔唑生物堿對菜青蟲酯酶活性的影響

處理菜青蟲酯酶的活性開始高于對照組，隨著處理時間的延長，酯酶活性逐漸升高，在72 h活性影響達到最大為1.7742 umol/ug pro/30min。處理組酯酶活性在24 h 和48 h 分別為同期對照的1.38 和1.49 倍，72 h 時活性達最高是同期對照組的2.59 倍。

3 結論與討論

目前，海洋微生物代謝產物藥用國內外研究報道較多，但用于農藥研究尤其用于殺蟲的研究報道很少，本研究由極地與深海兩種生境兼有的鏈霉菌獲得吲哚咔唑生物堿，經測試對菜青蟲、小菜蛾、美國白蛾及甘藍蚜等多種害蟲同時具有較強的觸殺、胃毒活性，展現出良好的殺蟲潛力，而殺蟲機理的探索對分析新農藥發揮的作用及毒性分析具有重要的意義。

國內外對殺蟲機理的研究主要集中在對試蟲組織病理學的觀察和各種酶的測試，其中酶在昆蟲生長和對農藥的反應中表現敏感，較容易測試，受到廣泛關注(呂敏，2009)。酚氧化酶參與昆蟲表皮的硬化、暗化，卵鞘的鞣化等作用，也是昆蟲防御反應和免疫能力的重要指標;昆蟲正常生長過程中，體壁外表皮的硬化形成外骨骼，阻礙了昆蟲的生長，幼蟲要周期性脫皮，才能繼續進行生長發育，幾丁質酶可調節昆蟲的周期性蛻皮并合成新表皮，由于這兩種酶與昆蟲特有的生長發育過程有關，而高等動物沒有這種生命過程，因此被認為研制對環境友好新型害蟲生物調控劑的重要作用靶標(高興祥，2004;劉偉，2010)。纖維素酶是昆蟲體內的水解酶，與取食植物的昆蟲體內消化系統密切相關;酯酶是昆蟲體內的重要的解毒代謝酶，參與各種外源毒物的代謝，當昆蟲取食非嗜食寄主植物后，可引起體內多種代謝酶活性的變化，以起到解毒作用。吲哚咔唑生物堿處理導致蟲體酯酶活性增高，表明試蟲對有毒物質產生應激反應，而酚氧化酶、幾丁質酶、纖維素酶活性降低，顯示影響昆蟲對食物的消化吸收及正常的生長發育，在癥狀上也表現出試蟲體變小，不能化蛹，進而死亡。綜上，該吲哚咔唑生物堿殺蟲活性強，作用機制也顯示對害蟲的特異性，值得做更進一步的研究。

References)

Benjamin ND，Montgomery MW.Polyphenol oxidase of royal ann cherries:purification and characterization［J］.Journal Food Science，1973，38:798-806.

Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

Chen ST，You QD.Anticancer activity of indolocarbazoles［J］.Progress in Chemistry，2008，20(2):368-374.［陳蘇婷，尤啟冬.哚咔唑類化合物及其衍生物的抗腫瘤活性［J］.化學進展，2008，20(2):368-374］

Gao XX，Luo WC，Yu TC，et al.The effects of benzoic acid compound series on PPO of Spodoptera exigua Hübner［J］.Chinese Journal of Pesticide Science，2004，6(1):26-30.［高興祥，羅萬春，于天叢，等.幾種苯甲酸類化合物對甜菜夜蛾多酚氧化酶活性的影響［J］.農藥藥學報，2004，6(1):26-30］

Hou Q.Effect of staurosporine induced apoptosis of MCF7/GFP-Bax stable cell line on Bax translocation from cytosol into mitochondria［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2008，43(4):378-382.［侯琦.Staurosporine 誘導人乳腺癌MCF7/GFP-Bax 非受體依賴途徑的細胞凋亡對Bax 自胞漿至線粒體轉移定位的影響［J］.藥學學報，2008，43(4):378-382］

Li LJ，Cai HN，Su WJ.Studies on bioactive substances from marine microorganisms.［J］Journal of Jimei University(NaturalScience)，2000，5(2):80-86.［李利君，蔡慧農，蘇文金.海洋微生物生物活性物質的研究［J］.集美大學學報(自然科學版)，2000，5(2):80-86］

Liu G.Camptothecin Insecticidal-Activity and Mechanism to Plutella Xylostellal［D］.Lin'an:Zhejiang Forestry University.2007，17-19.［劉剛，喜樹堿對小菜蛾的生物活性及作用機理研究［D］.臨安:浙江林學院，2007，17-19］

Liu W，Xue CB，Zhang JJ，et al.Inhibitory effect of tannic acid on growth，development and phenoloxidase activity of Spodoptera exigua larva［J］.Journal of Plant Resources and Environment，2010，19(1):32-37.［劉偉，薛超彬，張靜靜，等.單寧酸對甜菜夜蛾幼蟲生長發育及酚氧化酶活性的抑制作用［J］.植物資源與環境學報，2010，19(1):32-37］

Lv M.Preliminary Studies on the Insecticidal Activity and Action Mechanism of Fraxinellon［D］.Yangling:Northwest A ＆ F University，2009，28-30.［呂敏.梣酮的殺蟲活性及作用機理的初步研究［D］.楊陵:西北農林科技大學，2009，28-30］

Pan LQ，Wang KX.The experimental studies on activities of digestive enzyme in the larvae Penaeus chinensis［J］.Journal of Fisheries of China，1997，21(1):26-31.［潘魯青，王克行.中國對蝦幼體消化酶活力的實驗研究［J］.水產學報，1997，21(1):26-31］

Sanchezl J，Insuamm B.New cytotoxic indolic metabolites from a marine streptomyces［J］.Journal of Natural Products，2003，66(6):863-864.

Xu XR，Jiang HY，Zhang YN，et al.Bioactivity of Pharbitis purpurea extracts against Plutella xylostella［J］.Agrochemicals，2006，45(2):125-128.［徐向榮，蔣紅云，張燕寧，等.牽牛子提取物對小菜蛾的生物活性［J］.農藥，2006，45(2):125-128］

Zhang SY，Wang JB，Wang HF，et al.The relationship between activities of Chitinase and β-1，3-Glucanase and resistance to Rhizomania in sugar beet［J］.Acta Photophysiologica Sinica，2005，31(3):281-286.［張少英，王俊斌，王海鳳，等.甜菜幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶活性與其對叢根病抗性的關系［J］.植物生理與分子生物學學報，2005，31(3):281-286］