棉大卷葉螟吐絲基因片段的釣取及其意義

陳春霞，王中陽，顧桂香，楊益眾*，梁國華

(1.揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009;2.揚州大學教育部功能基因組重點實驗室，江蘇揚州 225009)

隨著轉基因棉花在我國的大面積種植，棉田化學農藥用量銳減，給棉花種植者和棉田生態環境保護帶來了無法估量的利益。然而，化學殺蟲劑用量減少后，棉田一些次要害蟲有抬頭趨勢。如棉大卷葉螟，其種群數量在長江中下游部分棉區有所回升(王厚振等，2002;劉芳等，2005;黃東林等，2005)，特別是八月中旬以后的第四代、第五代，種群數量大，卷葉率高，已成為棉花中后期的重要食葉性害蟲(陳建等，2008)。關于該害蟲的生物學特性、種群動態、發生與不同棉花品種及作物布局間的關系，前人已做過不少研究(康曉霞等，2006;康曉霞等，2007;陳建等，2008;陸佩玲等，2008;Lu et al.，2011)。然而，在轉基因棉花的生長后期如何控制棉大卷葉螟的種群密度、減少其為害，必須根據轉基因棉花的生長特點，從減少化學農藥用量的角度，制定防治該害蟲的新舉措。論文作者根據家蠶Bombyx mori 后部絲腺中絲素重鏈、輕鏈與P25 三種蛋白的性質(汪生鵬等，2009)，利用GenBank已經登錄的幾種吐絲昆蟲輕鏈基因的保守區域，經過一年多的研究探索，成功地釣取到了棉大卷葉螟的吐絲基因片段，并進行了基因測序。現將部分結果報告于下。

1 材料與方法

1.1 蟲源

試驗所用棉大卷葉螟蟲源采自揚州大學實驗農牧場棉田中，幼蟲飼以苘麻葉片，幼蟲化蛹羽化后每天飼以5%的蜂蜜水，至十月份后，將老熟幼蟲至于室外罩籠內，讓其自然越冬，以便隨時取用。

1.2 相關試劑

1.2.1 PCR 試劑

RNA 提取試劑:Promega 公司的SV Total RNA Isolation System 試劑盒;反轉錄試劑:TaKaRa 公司的PrimeScriptⅡ1stStrand cDNA Synthesis Kit 試劑盒;酶:TaKaRa 公司的TaKaRa Taq DNA 聚合酶和TaKaRa LA Taq;膠回收:TaKaRa 公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0 試劑盒。

1.2.2 克隆試劑

載體:TaKaRa 公司的pMD 18-T Vector;氨芐青霉素:上海潤興生物提供;感受態細胞:TaKaRa 公司的E.coli Competent Cells DH5α。

1.2.3 主要試劑的配制

LB 液體培養基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，溶解于1 L 超純水中，120℃，高壓滅菌20 min。LB 固體培養基:Bacto-tryptone(胰蛋白胨)10.0 g，Bacto-yeast extract(酵母提取物)5.0 g，NaCL 10.0 g，瓊脂粉12.5 g，溶解于1 L超純水中，120℃，高壓滅菌20 min。

1.3 RNA 的提取

參照王勛(2011)。一般流程為:取老熟幼蟲1 頭加液研磨、裂解、離心、孵育、洗脫、樣品保存。

1.4 RNA 的反轉錄

將樣品加入各種反轉錄液、進行反轉錄，冰上迅速冷卻。

1.5 引物設計

利用GenBank 上已經登錄的幾種吐絲昆蟲輕鏈基因的保守區域，設計兩對兼并引物，Fib-LF1:5'-AATGCTGCCCTTCGTTTT-3'，Fib-L-R1:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'和Fib-L-F2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，Fib-L-R2:5'-CACCWACGTTGTTACTGCG-3'，用于擴增輕鏈的核心區域。引物由上海生物工程公司合成。

1.6 基因中間片段的擴增

基因中間片段擴增的反應體系為25 μL:

cDNA 2.0 μL

10μM 上游引物 1.25 μL

10μM 下游引物 1.25 μL

2.5 mM dNTP 2 μL

10×PCR Buffer Mg2+plus 4.5 μL

Taq 酶 0.2 μL

ddH2O 13.8 μL

將反應液混勻，放入PCR 儀進行擴增，擴增條件為:

PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 膠回收

切出的目的 DNA 片段放入 1.5 mL 的Microtube 中，加入600 μL 的DR-ⅠBuffer(1mg凝膠視為1μL)，65℃加熱使膠塊完全融化，再加入DR-ⅠBuffer 量的1/2 體積量的DR-ⅡBuffer，均勻混合，離心，最后洗脫DNA。

1.8 體外連接和轉化

在Microtube 中配制下列混合液:

回收產物 4.5 μL

連接載體pMD18-T 0.5 μL

SolutionⅠ 5 μL

混合液用槍頭打勻后置于4℃冰箱中，反應4 h后進行轉化，轉化產物均勻打在培養基平板上，37℃培養箱過夜培養。

1.9 菌落篩選和測序

挑取單克隆，在LB 液體培養基中過夜培養后，經菌液PCR 檢測后含有特異目的基因的陽性克隆菌液，樣品送生工生物工程(上海)有限公司檢測。

2 結果與分析

經過研究探索，成功地釣取到了棉大卷葉螟吐絲基因片段，其長度約為600 bp(圖1-4)。翻譯成的氨基酸序列如圖5 所示。

圖1 RT-PCR 擴增結果Fig.1 Amplification of fibroin light chain(FLC)gene

圖2 膠回收結果Fig.2 The recovery of PCR product FLC gene

圖3 使用Fib-L-F1 和Fib-L-R1 引物菌液PCR 結果Fig.3 The result of PCR amplification using the primers of FLC-L-F1 and FLC-L-R1

圖4 棉大卷葉螟吐絲基因片段的測序結果Fig.4 FLC gene sequence of Sylepta derogata

圖5 棉大卷葉螟吐絲基因片段的氨基酸序列Fig.5 The deduced amino acid sequence of spinning gene fragement from Sylepta derogata

研究結果顯示，棉大卷葉螟吐絲基因輕鏈片長約在600 bp。將本結果得到的堿基序列與NCBI上登陸的一些吐絲昆蟲的堿基序列進行比對，結果與外米綴蛾Corcyra cephalonica 的同源性為71%，與大蠟螟Galleria mellonella 的同源性為70%，與家蠶Bombyx mori 的同源性僅為67%。說明棉大卷葉螟的吐絲基因片段有它的個性。

利用(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)估算基因的分子量和等電點，獲得的棉大卷葉螟絲素輕鏈基因相對分子量為53.6 kDa，等電點pI 為5.09。同時利用MEGA軟件將氨基酸序列構建基于輕鏈基因序列的系統進化樹，如圖6 所示。

圖6 基于輕鏈基因氨基酸序列的系統進化樹Fig.6 The phylogenetic tree based on the deduced amino acid sequences of light chain gene

3 結論與討論

目前對吐絲昆蟲的研究主要集中在經濟昆蟲、社會性(穴居)昆蟲及蜘蛛類，其目的是利用或模仿這些昆蟲(生物)的吐絲為經濟建設和國防事業服務。而本文則將研究目標轉移到農林有害吐絲昆蟲上，其研究結果為破解眾多農林害蟲的吐絲、結繭、轉移為害機制提供探索的先例。

本文僅是探討了棉大卷葉螟吐絲基因的輕鏈片段，要把整個棉大卷葉螟的吐絲基因序列包括重鏈基因、P25 基因等(Sutherland et al.，2007)全部描述清楚，還需要一個過程。同時，獲得的這種吐絲基因片段，如何進行表達，甚至利用基因干擾技術(RNAi)敲除該基因的表達(王志坤等，2008)、從而達到控制害蟲吐絲卷葉為害的目的，還有大量的工作需要摸索和闡述清楚。其實，基因干擾技術在植物保護領域的研究與運用已初現端倪。唐濤等研究了RNA 干擾對昆蟲抗藥性相關基因沉默的作用(唐濤等，2010);周慧丹等運用RNAi 介導法，將兩種蛋白基因注入棉鈴蟲Helicoverpa armigera 幼蟲體內，研究基因沉默后對Cry1Ac 毒力的影響，結果干擾后的幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性顯著下降(周慧丹等，2010)。王志坤等、?？『５确謩e綜述了RNA 干擾技術在植物抗病研究、寄生線蟲和根結線蟲研究中的應用(王志坤等，2008;?？『５?，2009);楊中俠等、楊廣等則較全面地綜述了RNAi 技術在昆蟲研究中的應用前景(楊中俠等，2008;何正波等，2009;楊廣等，2009)。因此，有了輕鏈基因片段，為今后進一步深入研究和利用生物技術控制此類害蟲的為害提供了先期基礎。

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