植物油與含水量對(duì)玫煙色棒束孢IfB01菌株分生孢子萌發(fā)率的影響

鄒春華，黎坤瑜，董廷艷，胡瓊波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642)

玫煙色棒束孢菌Isaria fumosorosea，以前稱玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus，是一個(gè)常見的蟲生真菌復(fù)合種(spcies complex)(Zimmermann，2008)，其寄主多樣，分布廣泛，常用于防治煙粉虱Bemisia tabaci、蚜蟲Aphis spp.、小菜蛾P(guān)lutella xylostella 等重要害蟲(Maketon et al.，2008;Shapiro-Ilan et al.，2008;Espinel et al.，2009;Mascarin et al.，2014)。IfB01 菌株是作者前期從煙粉虱感病尸體上分離篩選的玫煙色棒束孢菌菌株，該菌株對(duì)B 型煙粉虱有較好控制效果，其分生孢子在濃度為1.0×107spores/mL 對(duì)2 齡若蟲致死率達(dá)81%以上，2.5×106spores/mL 與1.25 mg/L 螺蟲乙酯混劑則達(dá)到87%以上的防效，但其分生孢子不耐貯藏。過去的實(shí)驗(yàn)表明，分生孢子含水量對(duì)玫煙色棒束孢菌分生孢子的保存壽命有顯著影響(陳宜濤和馮明光，2002;Bouamama et al.，2010a，2010b)，并且許多植物油也可以促進(jìn)孢子貯存期的延長(zhǎng)(Kim et al.，2011)。因此，本研究將考察孢子含水量及植物油對(duì)該菌株分生孢子不同貯藏時(shí)間萌發(fā)率的影響，以探索延長(zhǎng)孢子壽命的方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)

供試菌株:IfB01 菌株(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)CCTCC M 2012400)斜面菌種。

菌種培養(yǎng)與分生孢子收集:刮取IfB01 菌株斜面菌種的分生孢子，接種于PDA 平板上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-20 d 至表層產(chǎn)生大量分生孢子時(shí)，將適量的無菌水倒入培養(yǎng)皿，使無菌水沒過分生孢子層，用毛筆在水面下輕刮培養(yǎng)基表面，使分生孢子分散于無菌水中。將含有大量孢子的無菌水過325 目篩網(wǎng)濾去菌絲及PDA 殘?jiān)?，收集濾液，2000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，去除上清液，將分生孢子沉淀物于35℃干燥箱中烘干24 h，得到純凈分生孢子粉，備用。

1.2 分生孢子含水量測(cè)定

先將1.5 mL 離心管在75℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取0.3 g 孢子粉，輕輕滑入離心管內(nèi)，將其置于35℃低溫干燥，取出后放入硅膠干燥器冷卻再稱重，重復(fù)3 次，至恒重為止。含水量的計(jì)算公式為:

其中，m1為離心管質(zhì)量，m2為烘前離心管加孢子粉質(zhì)量，m3為烘后離心管加孢子粉質(zhì)量。

1.3 植物油處理

用1.5 mL 的離心管分裝0.3 g 孢子粉，向其中分別滴加約0.5 mL 大豆油(福臨門，中糧集團(tuán))、調(diào)和油(金龍魚，嘉里糧油)、花生油(金龍魚，嘉里糧油)、葵花籽油(福臨門，中糧集團(tuán))和玉米油(深圳南順)，充分混勻，以不加植物油的孢子粉為空白對(duì)照(CK)，重復(fù)3 次，離心管用帕拉膠膜封口后于25℃下保存。

1.4 分生孢子萌發(fā)率測(cè)定

分別于貯藏7 d、30 d、90 d 后，用滅菌牙簽挑出少許分生孢子貯藏物，放入裝有0.2%吐溫-80 離心管中充分震蕩，制成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子濃度約在105-106spores/mL。吸取100 μL 懸浮液均勻涂布在PDA 平板上，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在顯微鏡下檢查3個(gè)視野，記錄孢子總數(shù)與萌發(fā)數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物油對(duì)玫煙色棒束孢菌分生孢子萌發(fā)率影響

植物油能夠提高分生孢子的萌發(fā)率(如表1)，在貯藏后第7 天，對(duì)照的孢子萌發(fā)率為65%左右，而5種植物油處理的孢子萌發(fā)率都大于80%;在貯藏后第30 天，對(duì)照的孢子萌發(fā)率急劇降低到5%左右，而5種植物油處理的孢子萌發(fā)率仍然維持在66%-81%之間;然而，至貯藏90 d 后，植物油處理的孢子相互粘結(jié)，雖然有少量萌發(fā)，但無法精確測(cè)定其萌發(fā)率，估計(jì)小于5%，而此時(shí)對(duì)照的孢子萌發(fā)率則降至零。

植物油品種之間比較，不管孢子含水量怎樣變化，五種植物油處理的孢子萌發(fā)率都沒有顯著性差異(圖1)。

2.2 孢子含水量對(duì)植物油貯分生孢子萌發(fā)率的影響

孢子含水量對(duì)貯藏初期(7 d)及對(duì)照的孢子萌發(fā)率沒有影響，但對(duì)植物油處理的貯藏30 d 后分生孢子之萌發(fā)率顯著影響(圖2)。貯藏后30 d，含水量為3.13%的處理，不管采用哪種植物油，其油貯孢子萌發(fā)率在80%左右，顯著性高于含水量為9.13%和18.83%的處理的75%左右和70%以下的萌發(fā)率。

表1 植物油與孢子含水量對(duì)分生孢子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of plant oils and differentmoisture content on conidia germination rates

3 結(jié)論與討論

蟲生真菌分生孢子是其重要的繁殖體，也是真菌殺蟲劑的主要成份，因此，如何延長(zhǎng)分生孢子的壽命，提高其萌發(fā)率，是真菌殺蟲劑制劑加工中一個(gè)必需解決的問題。然而，分生孢子的壽命控制機(jī)理非常復(fù)雜，有種質(zhì)遺傳因素，也與環(huán)境因素(比如溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)條件、氧氣及其所處的化學(xué)環(huán)境等)密切相關(guān)，在目前對(duì)于分生孢子在什么條件下進(jìn)入休眠與解除休眠及其機(jī)理缺乏認(rèn)識(shí)的情況下，通過大量實(shí)驗(yàn)工作來研究延長(zhǎng)孢子壽命的技術(shù)手段具有實(shí)際意義。本研究發(fā)現(xiàn)，五種植物油及低含水量能夠延長(zhǎng)IfB01 菌株分生孢子的貯存時(shí)間，與前人(雷仲仁等，2003;谷祖敏等，2013;Kim et al.，2013)研究報(bào)道油類可提高不同真菌孢子萌發(fā)率的結(jié)果具有相似性，進(jìn)一步說明，油類似乎可廣泛延長(zhǎng)不同蟲生真菌孢子的壽命。

然而，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，植物油貯分生孢子在貯藏90 d 以后，發(fā)生粘結(jié)現(xiàn)象，致使無法檢測(cè)其萌發(fā)率，這種現(xiàn)象將影響油劑的使用價(jià)值。在以后的油劑加工研究中，可考慮添加適當(dāng)助劑，增加其分散性，以解決此問題。

References)

Bouamama N，Vidal C，F(xiàn)argues J.Effects of fluctuating moisture and temperature regimes on the persistence of quiescent conidia of Isaria fumosorosea［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2010a，105(2):139-144.

Bouamama N，Vidal C，F(xiàn)argues J.Effects of wetting on the persistence of quiescent conidia of Isaria fumosorosea［J］.Biological Control，2010b，55(3):203-210.

Chen YT，F(xiàn)eng MG.Optional drying procedures for mass production of Paecilomyces fumosoroseus conidia for insect control［J］.Mycosystema，2002，21(4):565-572.［陳宜濤，馮明光.害蟲防治用玫煙色擬青霉分生孢子粉的干燥工藝優(yōu)化［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21(4):565-572］

Espinel CC，Torres TL，Marina CPA.Effect of entomopathogenic fungi over development stages of Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)［J］.Revista Colombiana de Entomologia，2009，35(1):18-21.

Gu ZM，Zhou F，Chen S，et al.An oil formulation of Verticillum lecanii VL17 and its bioassy in laboratory［J］.Agrochemicals，2013，52:337-339.［谷祖敏，周飛，陳思，等.蠟蚧輪枝菌VL17 油劑配方篩選及室內(nèi)毒力評(píng)價(jià)［J］.農(nóng)藥，2013，52:337-339］

Kim JS，Je YH，Woo EO.Persistence of Isaria fumosorosea(Hypocreales:Cordycipitaceae)SFP-198 conidia in corn oil-based suspension［J］.Mycopathologia，2011，171(1):67-75.

Lei ZR，Wen JZ，Tan ZH，et al.Field trial with Metarhizium oil liquid for controlling Locusta migratoria manilensis(Meyen)［J］.Plant Protection，2003，29:17-19.［雷仲仁，問錦曾，譚正華等，2003.綠僵菌油劑防治東亞飛蝗田間試驗(yàn)［J］.植物保護(hù)，2003，29:17-19］

Maketon M，Orosz-Coghlan P，Jaengarun J.Field evaluation of Isaria fumosorosea in controlling the diamondback moth(Plutella xylostella)in Chinese kale［J］.Phytoparasitica，2008，36(3):260-263.

Mascarin GM，Kobori NN，Quintela ED.Toxicity of non-ionic surfactants and interactions with fungal entomopathogens toward Bemisia tabaci biotype B［J］.Biocontrol，2014，59(1):111-123.

Shapiro-Ilan DI，Cottrell TE，Jackson MA.Virulence of Hypocreales fungi to pecan aphids(Hemiptera:Aphididae)in the laboratory［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2008，99(3):312-317.

Zimmermann G.The entomopathogenic fungiIsaria farinosa(formerly Paecilomyces farinosus)and the Isaria fumosorosea species complex(formerly Paecilomyces fumosoroseus):biology，ecology and use in biological control［J］.Biocontrol Science and Technology，2008，18(9):865-901.