棉鈴蟲β-catenin 基因的克隆、表達分析及真核表達載體構建

陳 偉，徐衛華

(1.廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣州 510006;2.中山大學生命科學學院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510275)

β-連環蛋白(β-catenin)是一個多功能蛋白，它可以作為細胞骨架蛋白，與E-cadherin 形成復合體，介導細胞間的粘附作用。此外，更為科研工作者所關注的是其在Wnt/β-catenin 信號通路中的作用(Bienz，2005)。β-catenin 是Wnt/β-catenin 信號通路的重要成員，該通路的活性取決于細胞質中自由β-catenin 的多少，自由的β-catenin 可以由細胞質進入細胞核，與T 細胞因/淋巴細胞增強結合因子(TCF/LEF)結合而活化下游靶標基因的轉錄(Schuijers et al.，2014)。Wnt/β-catenin 信號通路是當前生物學研究的熱點之一，該通路在調節細胞增殖、胚胎發育和腫瘤的發生發展方面起著重要的生物學作用(Logan and Nusse，2004;Clevers and Nusse，2012)

棉鈴蟲Helioverpa armigera 是一種世界性的農業害蟲，其危害的經濟作物較多，每年給全球農業造成很大的經濟損失。棉鈴蟲以多種方式適應外界惡劣的環境條件，滯育是其中一種重要的方式(徐衛華，2008)。滯育是指昆蟲發育的停滯，其重要的特征是發育緩慢、代謝速率下降以及抗逆性增強(Denlinger，2002)。滯育并非發育的完全停止，而是另外一種特殊的發育狀態，滯育過程中部分基因的表達下降，也有部分基因的表達上升(Lu and Xu，2010;Bao and Xu，2011)。對棉鈴蟲滯育進行研究，有較大的理論意義和應用價值。棉鈴蟲滯育的激素調節已經研究得比較透徹，但從分子水平闡述滯育機制的研究較少(朱佳等，2010)。鑒于Wnt/β-catenin 信號通路在發育中的重要作用，我們通過克隆β-catenin 基因并比較分析滯育和非滯育蛹腦中β-catenin 基因的表達水平變化，試圖窺探Wnt/β-catenin 信號通路是否在棉鈴蟲滯育過程中起作用。

本研究首先運用 RACE 技術(rapid-amplification of cDNA ends)首次克隆了棉鈴蟲的β-catenin 基因，分析了其在滯育和發育蛹腦的差異表達情況，并構建真核表達質粒，為進一步研究Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲發育過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗昆蟲

棉鈴蟲為本課題組所飼養，品系由南京農業大學蘇建亞教授提供，原產河南省。保種用的棉鈴蟲一直在25oC，14L∶10D(光照:黑暗)的條件下飼養。滯育型棉鈴蟲的1-3 齡幼蟲在25oC 條件下培養，光照條件設定為14L∶10D;生長到3 齡末期，將其轉移到20oC 恒溫培養箱，光照條件為10L∶14D。非滯育型棉鈴蟲的飼養過程與滯育型相同，差別在于其光照條件一直保持在光照14 h。

1.2 菌株、載體、細胞和試劑

大腸桿菌DH5α、昆蟲表達載體pIZ/v5-GFP、美洲棉鈴蟲Helioverpa zea 的卵巢細胞HzAm1均為本實驗室保存;pMD18-T 載體、Taq DNA polymerase 及限制性核酸內切酶購自Takara 公司;RACE 試劑盒購自Clontech 公司;M-MLV 反轉錄試劑盒購自Promega 公司;Trizol ? Reagent 購自Invitrogen 公司;質粒DNA 小量提取試劑盒、DNA產物純化試劑盒購自愛思進生物技術有限公司;蛋白Marker、HRP 偶聯的羊抗兔二抗以及Western blot 所用發光液均購自Thermo 公司。其它試劑均為分析純(A.R.)。

1.3 引物設計和合成

本研究所用的引物，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。具體序列及說明見表1。設計簡并引物時，參考已報道的棉鈴蟲近緣物種序列，如家蠶Bombyx mori，帝王蝶Danaua plexippus 和煙草天蛾Manduca sexta，找到保守的DNA 序列，以此設計簡并引物。原則是盡量選用包含簡并堿基少的序列，引物長度為16-18 堿基。

1.4 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

按照試劑盒提供的方法，取一定量的組織，加入1 mL Trizol 進行勻漿，提取總RNA。取1 μg RNA 進行逆轉錄，合成第一鏈cDNA。

1.5 RACE

按照試劑盒提供的說明，使用特定的接頭作為反轉錄引物，取1 μg RNA 為模板，分別合成5'-RACE-Ready cDNA 和3'-RACE-Ready cDNA。用基因特異性引物和試劑盒提供的UPM 引物進行第一輪PCR 擴增;擴增產物稀釋后作為模板，以基因特異性引物和試劑盒提供的NUP 引物進行第二輪PCR 擴增。擴增后的片段與pMD18-T 載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，鑒定正確后測序分析。

1.6 序列分析

利用 DNAStar 對序列進行分析和預測β-catenin 的ORF(開放閱讀框)。用MEGA 6.06軟件進行遺傳距離分析，并用Maximum liklihood法構建系統進化樹。

1.7 棉鈴蟲蛹腦中β-catenin 的表達分析

取15個蛹腦，按照1.4 的方法合成第一鏈cDNA，PCR 檢測β-catenin 的表達情況，以RpL32 作為內參對照。

1.8 真核表達載體的構建

設計引物，正向引物帶BamHI 酶切位點，反向引物帶XbaI 酶切位點，PCR 擴增β-catenin 編碼區全長。用BamHI 和XbaI 對擴增產物進行雙酶切后，與同樣雙酶切的pIZ/v5-GFP 載體進行連接。轉化大腸桿菌DH5α，鑒定后進行測序確認。

1.9 細胞培養、轉染及細胞定位研究

HzAm1 是一種半貼壁細胞，培養所需的培養基為含10%胎牛血清的Grace's 昆蟲培養基。在不含CO2的27℃細胞培養箱中進行培養。24 孔板中細胞密度約90%時進行轉染，48 h 后按1∶1000 的比例加入5 mg/mL Hoechst 33342 染料，染核10 min后在倒置熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達情況，根據細胞核的位置判斷目的蛋白的亞細胞定位。

1.10 Western blot 檢測

轉染48 h 后，提取蛋白，用Bradford 法測定蛋白濃度。取10 μg 蛋白上樣電泳，100 v 轉膜1 h。5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h 后分別用V5 標簽抗體(1∶5000)和二抗(1∶3000)進行孵育，最后進行曝光顯影。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲β-catenin 基因的克隆與氨基酸序列分析

根據近緣物種的β-catenin 基因序列，設計了兩對簡并引物。利用巢式PCR 的方法，擴增出了一條約700 bp 的條帶，大小與預期相符(圖1A)。對該片段測序分析，發現其與近緣物種的相似度較高。根據測定的序列設計基因特異性引物，進行3'-Race 和5'-Race，分別獲得了1611 bp和942 bp 的條帶(圖1B 和1C)。測序后進行拼接，獲得了棉鈴蟲β-catenin 基因的全長cDNA 序列，命名為Har-β-catenin(Genbank 登錄號為KJ206237)。

Har-β-catenin 全長2682 bp，其中開放閱讀框2382 bp，編碼一個793 aa 的蛋白質，預測其分子量為86.7 kDa(圖2)。已報道的β-catenin 蛋白的一個共同特征是具有多個ARM 重復結構域(Armadillo/β-Catenin-like repeats)，將預測的棉鈴蟲β-catenin 蛋白質序列提交在線蛋白質分析工具ExPASy(http://prosite.expasy.org/)進行分析，結果也找到了多個ARM 重復結構域(圖2)，這說明β-catenin 蛋白是一個在生物進化上非常保守的蛋白質。

圖1 Har-β-catenin 基因擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR products of Har-β-catenin by agarose gel electrophoresis

圖2 Har-β-catenin cDNA 序列及推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA and the duduced amino acid sequences of Har-β-catenin

2.2 棉鈴蟲β-catenin 與其它昆蟲β-catenin 的系統進化分析

運用MEGA 6.06 軟件對棉鈴蟲和其它已報道的部分昆蟲β-catenin 進行系統進化樹的分析，結果表明棉鈴蟲首先與家蠶聚到一起，然后與帝王蝶聚為一支。該支與蠅科的果蠅和家蠅、實蠅科的地中海實蠅Ceratitis capitata、蚊科的埃及伊蚊Aedes aegypti 和致倦庫蚊Culex quinquefasciatus 有較近緣的關系，最后聚為一大支(見圖3)。

2.3 Har-β-catenin 在滯育和發育蛹腦中的表達變化

選取化蛹后0、5、10 和15 d 的棉鈴蟲，利用RT-PCR 檢測Har-β-catenin 基因在棉鈴蟲滯育蛹腦和非滯育蛹腦中的差異表達情況，RpL32 基因作為內參對照。結果表明，Har-β-catenin 在兩種發育狀態的蛹腦中均有表達。如圖4B 所示，非滯育蛹腦中Har-β-catenin 的表達量較高，且隨著發育的進行表達量逐步上升，而滯育蛹腦中的表達較低。

圖3 Har-β-catenin 與其它昆蟲β-catenin 的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on amino acid sequences of Har-β-catenin protein

圖4 Har-β-catenin 在棉鈴蟲蛹腦中的表達變化Fig.4 Expression pattern of Har-β-catenin in brains of Helicoverpa armigera

2.4 Har-β-catenin 真核表達質粒的構建及亞細胞定位研究

為了進一步研究棉鈴蟲β-catenin 基因的功能，構建了Har-β-catenin 的真核表達載體。驗證正確的質粒轉化棉鈴蟲HzAm1 細胞，用識別載體本身表達的V5 序列的標簽抗體進行Western blot發現，在稍小于140 kDa 處有一條特異的條帶，與預期大小一致(Har-β-catenin 86.7 kDa，載體本身表達的GFP 和V5 約35 kDa)，說明構建的載體可以在HzAm1 細胞中正確表達。亞細胞定位實驗如圖5B 所示，Har-β-catenin 主要在細胞質中表達，預示著正常培養的棉鈴蟲細胞Wnt/β-catenin 信號通路未被激活。

圖5 Har-β-catenin 真核表達及亞細胞定位研究Fig.5 Eukaryotic expression and subcellular localization of Har-β-catenin

3 結論與討論

β-catenin 在進化上高度保守，它是一個多功能蛋白，通過形成不同的蛋白復合物而參與調節不同的生理功能(Damalas et al.，1999)。在細胞中，β-catenin 主要參與形成兩個重要的蛋白復合物(Kimelman and Xu，2006):①β-catenin 作為細胞骨架蛋白，通過α-catenin 在細胞膜處與E-cadherin(上皮細胞鈣粘蛋白)形成復合物(Jou et al.，1995)。該復合物介導同質細胞間的粘附，在抑制腫瘤侵襲、防治細胞的移動等方面發揮重要的生理功能(王啟明等，2006)。②β-catenin同時也是Wnt/β-catenin 信號通路中的至關重要的組分，通過與TCF/LEF 轉錄因子結合從而激活下游一系列靶標基因，如c-myc 和cyclin D1 等的轉錄。

Wnt/β-catenin 通路的框架的建立主要是源于對果蠅的研究。1991年Peifer 等人發現果蠅的armadillo 基因(β-catenin 同源基因)在Wnt/β-catenin 信號通路中起調節作用(Peifer et al.，1991)。之后該通路的其它成員也逐步被鑒定出來。目前，除了在模式生物果蠅中的研究，家蠶中β-catenin 的表達及作用也有一些報道(Dhawan and Gopinathan，2004)，而其它昆蟲中β-catenin的研究很少。

本研究通過分析已知的棉鈴蟲近緣物種β-catenin 基因的序列，設計簡并引物擴增棉鈴蟲β-catenin 基因的中間片段，然后通過RACE 技術得到了棉鈴蟲β-catenin 基因的cDNA 序列。對其推導的氨基酸序列提交ExPASy 網站進行分析，發現其具有多個ARM 重復結構域。ARM 重復結構域是由約42個氨基酸組成的，一般認為該結構域作為分子適配器，協調β-catenin 蛋白之間的作用(Peifer，1995)。已報道的β-catenin 蛋白都含有多個串聯的ARM 重復結構域，如人的β-catenin蛋白大小為92 kDa，含有13個ARM 重復結構域(Ilyas et al.，1997)。

克隆棉鈴蟲β-catenin 基因的cDNA 序列后，通過RT-PCR 的方法比較了滯育和非滯育蛹腦中β-catenin 基因的表達情況，結果表明滯育蛹腦中β-catenin 的表達水平明顯低于非滯育蛹腦。這預示著非滯育蛹腦，也就是正常發育的棉鈴蟲蛹腦中Wnt/β-catenin 信號通路活性有可能要強于滯育蛹腦。換一句話說，有可能滯育蛹腦中Wnt/β-catenin 信號下調，從而使棉鈴蟲的發育受到抑制。當然，還需要進一步的證據才能確定該推論，因為β-catenin 除了在Wnt/β-catenin 信號通路中起作用外，還是細胞骨架的組成成分。在后續研究中，尚需作進一步的研究來調查棉鈴蟲滯育和非滯育蛹腦中Wnt/β-catenin 信號通路的活性，以確定該通路在棉鈴蟲滯育中的作用。

綜上所述，本研究所取得的這些階段性成果，為后續深入研究Wnt/β-catenin 信號通路在棉鈴蟲滯育中的作用奠定了一定的基礎。

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