PLEKHQ1基因敲除小鼠基因型鑒定方法*

張鵬飛 張 硌* 陸 琤 周晨辰

PLEKHQ1基因敲除小鼠基因型鑒定方法*

張鵬飛①張 硌①*陸 琤①周晨辰①

目的：探討鑒定PLEKHQ1基因敲除(KO)小鼠基因型的方法。方法：對PLEKHQ1基因敲除雜合子小鼠進行單獨飼養及配種繁殖，繁殖后其子代出現野生型、雜合子型及純合子型3種基因型，提取每只小鼠的基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(PCR)和變性方法進行基因類型鑒定。結果：采用PCR和變性法成功鑒定出PLEKHQ1基因敲除小鼠的基因型。結論：這種無需T7酶切的小鼠基因型鑒定方法可用于PLEKHQ1基因敲除小鼠的基因型鑒定。

基因敲除小鼠；PLEKHQ1；變性；純合子；雜合子

DOI∶ 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.08.001

[First-author’s address] Department of Medical Engineering, 307 Hospital of PLA, Beijing 100071, China.

PLEKHQ1全稱為pleckstrin homology domain containing family Q member 1縮寫為Q1，屬于含有PH結構域的蛋白超家族，目前為止尚未見任何文獻專門對其功能進行報道。生物信息學分析顯示，Q1可能參與細胞因子與受體的相互作用，并且可能在巨噬細胞功能調控，尤其是巨噬細胞介導的炎性反應過程中發揮作用。為了揭示Q1在巨噬細胞介導的炎性反應中的作用，除了利用已經構建的Q1穩定敲低的RAW264.7細胞株等進行實驗外，實驗室于2014年成功建立了Q1基因敲除雜合小鼠。基于此，本研究采用PCR和變性法成功鑒定出由Q1基因敲除雜合小鼠繁殖獲得的子代小鼠的基因型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Q1基因敲除雜合(Q1+/-)小鼠由賽業(廣州)生物科技有限公司建立，利用類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術獲得，品系為C57BL/6，SPF級，共3只(雄性)，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0032；合格證號：444104000000214。野生型(wide type，WT) C57BL/6小鼠由軍事醫學科學院提供，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級條件飼養。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

試劑包括：①鼠尾裂解液(SA)，NaOH(5 mol/ L)50 μl，EDTA(0.5 mol/L，pH值為8.0)50 μl，置入超純水中至10 ml；②刺激緩沖液(SB)，Tris-HCl(1 mol/L，pH值為8.0)400 μl，置入超純水中至10 ml；③KOD-Plus-Neo(1.0 U/μl)(配套試劑有10×聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR Buffer for KOD-Plus-Neo、2 mmol/L dNTP、2 mmol/L MgSO)；④瓊脂糖(美國Amresco公司)；⑤10×TBE緩沖液(Tris 10.8，20 mmol/L EDTA，硼酸5.5 g，加水至100 ml，調整pH值為8.3)。

1.2.2 儀器

實驗儀器包括：①GL-1800型干式恒溫器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)；②Thermo LABOFUGE 400R低溫離心機(美國Thermofisher公司)；③C1000 TouchTMPCR儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司)；④DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；⑤WD-9413B凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 基因敲除小鼠的飼養和繁殖

建立Q1基因敲除雜合子小鼠后，置于軍事醫學科學院實驗動物中心SPF級動物房內飼養和繁殖。室內飼養溫度為18～22 ℃，相對濕度為40%～70%，明暗循環為12 h/d，小鼠自由飲水和飲食。小鼠籠盒、木屑墊料、飼料及飲用水均經過高溫、高壓消毒滅菌處理。在飼養過程中，每周一和周四進入SPF動物房觀察和記錄小鼠的生長情況，每周更換2次小鼠墊料，每日補充飼料和飲用水。繁殖初期將1只雄性雜合鼠與2只雌性野生鼠進行合籠飼養，小鼠的性成熟期約為8周，雌性鼠妊娠期約為21 d，繁殖出F2代子鼠后將1只雄性雜合鼠與2只雌性雜合鼠進行合籠飼養，繁殖出F3代子鼠[1]。

1.4 小鼠的基因型鑒定

由于F2代Q1基因敲除小鼠均為雜合子，其子代小鼠可能出現野生型(Q1+/+，WT)、雜合子(Q1+/-，HET)和純合子(Q1-/-，KO)3種表型，故需對其子代小鼠進行基因類型鑒定。其中，通過基因型測序(北京天-輝遠生物科技有限公司)確定了部分F3代子鼠的基因型，并確定獲得了野生型、純合子和雜合子，為后續實驗奠定基礎。

1.4.1 小鼠基因組DNA提取

剪取小鼠尾尖0.5 cm放入1.5 ml的離心管(EP管)中，加入100 μl的SA裂解液，覆蓋小鼠尾部，95 ℃處理30 min，然后加入100 μl的SB裂解液，搖蕩，直至組織消失，以3000 r/min離心5 min，提取其小鼠DNA。

1.4.2 PCR擴增反應及瓊脂糖凝膠電泳

引物由賽業(廣州)生物科技有限公司設計，并由北京天-輝遠生物科技有限公司合成，Q1基因引物分別是Primer F：GCTTCATGGCAACAGCCCTCA；Primer R：GAGCCTTCCAGCCACAGTCTTAGG。PCR擴增反應體系根據KOD-Plus-Neo使用說明，按20 μl反應體系進行擴增。分別加入反應物：DNA模板5 μl、F引物(10 μmol/L)1 μl、R引物(10 μmol/L)1 μl、KOD-Plus-Neo(1.0 U/μl)0.4 μl、10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2 μl、2 mmol/ L dNTP 2 μl和2 mmol/L MgSO42 μL，加ddH2O補足至20 μl。PCR反應循環設置為：①94 ℃預變性3 min；②98 ℃變性10 s、59 ℃退火30 s及68 ℃延伸30 s/ kb min，循環35次；③72 ℃ 5 min后終止反應。取PCR產物10 μl，加入6×Gel Loading后混勻，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像分析儀進行分析。

1.4.3 變性反應及瓊脂糖凝膠電泳的基因類型鑒定

本研究設計了一種無需T7酶切的TALEN技術基因敲除小鼠基因型鑒定的方法，其原理是利用含發夾結構域的雙鏈DNA較純線性雙鏈DNA具有較小的電泳遷移率的特點，對含發夾結構的雙鏈DNA可以通過T7酶切的方法進行基因型判斷，從而區分出野生型和純合子[2]。

(1)利用測序已確定的小鼠基因型設計實驗：①DNA模板中有2組為對照組，即已知WT(5 μl)和KO(5 μl)混勻后的樣品(10 μl)以及雜合子(10 μl)；②其余為實驗組，即已知野生型小鼠WT(10 μl)、純合型小鼠KO(10 μl)以及WT和KO的PCR擴增產物各5 μl，將其混勻于95 ℃變性5 min，其產物在室溫下自然冷卻。將上述各樣品進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析儀進行分析，其分析結果如圖1所示。

圖1 各基因型PCR產物變性前后電泳圖

圖1 顯示，WT與WT、KO與KO混合變性后的產物均為1條帶，并且WT和KO混勻變性后的產物與非變性的產物不同，但是與雜合子的基因型相同，為2條帶，表明可以利用WT與KO變性的方法對非雜合的PCR產物進行分析，從而判斷出野生型和純合子型。

(2)無需T7酶切的Q1-KO小鼠基因型鑒定方法具體流程如圖2所示。

圖2 變性法Q1-KO小鼠基因型鑒定方法流程圖

2 結果

根據流程圖，按照變性方法進行基因型鑒定。小鼠為6號籠中3周大小的小鼠，剪其尾部，分別編號為1～11號，裂解并提取DNA，進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像分析儀得到圖像，結果顯示，除2號、4號、8號和10號為1條帶外，其余均為2條帶，即為雜合子(如圖3所示)。

圖3 PCR產物變性前電泳圖

將2號、4號、8號和10號分別與已知的WT和KO混合、變性之后進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像分析儀得到圖像，其結果顯示，2號和4號與WT混合變性后為2條帶，而與KO混合變性后為1條帶，因此為純合子；8號和10號與WT混合變性后為1條帶，而與KO混合變性后為2條帶，因此為野生型小鼠(如圖4所示)。

圖4 PCR產物變性后電泳圖

3 討論

TALEN技術[3]是一種嶄新的分子生物學技術手段，克服了以往基因修飾技術中鋅指蛋白(zinc finger protein，ZFP)等不能靶向所有序列、脫靶切割及設計繁復等諸多缺點，能夠特異性地實現對任意靶目標DNA的敲除、敲入或點突變[4-5]。其原理是利用TALE和ForkⅠ限制性核酸內切酶的催化區域融合為TALEN，保留TALE的DNA靶序列特異識別功能及ForkⅠ的DNA酶活性[6-7]。目前，該技術已成功地在斑馬魚、線蟲、大鼠、小鼠及果蠅等物種的細胞實現了基因組定點突變[8-11]。引進的Q1基因敲除小鼠是通過TALEN技術剪切目標基因外顯子DNA，使DNA發生修復后形成移碼突變，從而使控制Q1蛋白表達的基因失活，達到實現Q1基因敲除的目的。Q1基因敲除動物模型的構建目前在國內、外均未見報道。

本研究引進的基因敲除小鼠嚴格遵循SPF級動物標準管理，飼養和繁殖方法均參照文獻[12]進行。由于本研究建立的Q1基因敲除小鼠均為雜合子，因此其子代有可能出現WT、KO及HET的3種表型，采用PCR擴增小鼠基因組DNA、再用T7酶切的變性方法成功進行了基因型鑒定。在實驗過程中，為不影響小鼠正常生長、保證存活率，選擇出生3周左右即離乳后小鼠，剪取尾部組織進行基因鑒定。為了確保鑒定結果的準確性，先通過每個樣本瓊脂糖凝膠電泳區分開2條帶的雜合子，然后將1條帶的樣品分別與已知確定的WT、KO混合，然后通過凝膠成像分析儀判斷瓊脂糖凝膠上每組分別對應帶的數量，繼而判斷基因型。由于利用CRISPR/CAS9技術建立的基因敲除小鼠與TALEN技術建立基因敲除小鼠均為短基因片段缺失類型，因此，本實驗方法同樣適用于CRISPR/ CAS9技術建立的基因敲除小鼠的基因型鑒定[13-15]。

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The method of the identification of the PLEKHQ1 gene knockout mice

ZHANG Peng-fei, ZHANG Ge, LU Cheng, et al
China Medical Equipment,2015,12(8)∶1-3.

Objective∶ To identify PLEKHQ1 gene knock-out mice. Methods∶ The PLEKHQ1 gene knock-out heterozygote mice were bred alone and copulated. The offsprings were to have three genotypes: wild genotype, heterozygote genotype and homozygote genotype. Genomic DNA was obtained from each pups and were subjected to PCR and Denature to identify the genotype. Results∶ The identification of PLEKHQ1 gene knockout mice is successful. Conclusion∶ The identification method of PLEKHQ1-KO mice without T7 can correct identify PLEKHQ1 gene knockout mice.

Knockout mice; PLEKHQ1; Denature; Homozygote; Heterozygote

1672-8270(2015)08-0001-03

R-332

A

張鵬飛,女,(1984- ),碩士，助理工程師。解放軍第307醫院醫學工程科，從事細胞信號轉導研究工作。

2015-03-24

國家自然科學基金(31400739)“PH結構域蛋白PLEKHQ1協調巨噬細胞遷移與激活的機制研究”；北京市自然科學基金(5144033)“PH結構域蛋白PLEKHQ1調控巨噬細胞激活及遷移的機制研究”

①解放軍第307醫院醫學工程科 北京 100071

*通訊作者：marbleluo@126.com