拉帕替尼聯(lián)合順鉑對人食管癌細胞株Eca-109增殖的抑制作用

陳逢生，陳曉華，曹小龍，鄔要芬，張曉娜，李黎波，羅榮城

(1南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州510315;2廣州市番禺中心醫(yī)院)

拉帕替尼為表皮生長因子(EGFR)和2型人表皮受體(HER2)的細胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域的靶向型激酶抑制劑，可阻斷EGFR和HER2下游區(qū)發(fā)信號途徑，從而抑制受體自磷酸化作用［1～5］。目前，尚無拉帕替尼用于食管癌臨床的報道，但其對食管癌細胞增殖有顯著的抑制作用［6］。順鉑為周期非特異性化療藥，已廣泛用于食管癌治療［7，8］。但是，拉帕替尼與順鉑聯(lián)合是否存在協(xié)同效應(yīng)，則需進一步研究。2013年9月～2014年9月，我們通過分析不同濃度的拉帕替尼及順鉑對人食管癌細胞株Eca109的增殖抑制作用，并明確兩者是否對Eca109存在協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109購自中科院細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，小牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(上?；瘜W試劑公司)，EDTA(汕頭光華化學廠)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠)，臺式低溫高速離心機(Thermo公司)，拉帕替尼(葛蘭素史克)，順鉑(江蘇豪森)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理 培養(yǎng)條件:RPMI-1640培養(yǎng)基，10%小牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置于 37℃、5%CO2恒溫孵育箱。當對數(shù)生長期細胞長滿培養(yǎng)瓶80%左右時，0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA 消化 30～60 s，鏡下觀察細胞大部分變形后棄消化液;加入RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打;1 500 r/min離心5 min，去上清;加入全培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL;接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將細胞分為4組，每組每濃度4個復(fù)孔。A組只加入培養(yǎng)液200 μL;B組(拉帕替尼)、C組(順鉑)加入不同藥物濃度的培養(yǎng)液200 μL，使拉帕替尼終濃度分別為 0.05、0.5、1、2.5、5、12.5、25 μmol/L，順鉑終濃度分別為 0.5、1、2、4、8、16、32 μg/L;D組(拉帕替尼聯(lián)合順鉑)分別為0.05 μmol/L+0.5 μg/L、0.5 μmol/L+1 μg/L、1 μmol/L+2 μg/L、2.5 μmol/L+4 μg/L、5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細胞抑制率檢測 采用MTT法。每孔加入MTT 20 μL，避光培養(yǎng)4 h后去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL。于振蕩器上搖勻后酶標儀測 OD值，計算細胞抑制率。細胞抑制率=1-(實驗組OD-本底組OD)/(空白對照組OD-本底組)。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 聯(lián)用效果判斷 采用協(xié)同作用q值判斷拉帕替尼與順鉑聯(lián)用的效果。q=EAB/(EA+EB-EA×EB)。式中EA和EB為各藥單用抑制率，EAB為合用抑制率。q≥1.15為協(xié)同作用，0.85～1.15為相加作用，＜0.85為拮抗作用。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞抑制率比較 見表1。

表1 各組細胞抑制率比較(%，±s)

表1 各組細胞抑制率比較(%，±s)

注:1～7 分別對應(yīng)拉帕替尼終濃度 0.05、0.5、1、2.5、5、12.5、25 μmol/L 和(或)順鉑終濃度 0.5、1、2、4、8、16、32 μg/L。

組別 1 2 3 4 5 6 7F P B 組 0.23 ±0.11 0.19 ±0.11 0.43 ±0.31 0.46 ±0.40 0.75 ±0.14 0.85 ±0.04 0.82 ±0.10 5.003 0.006 C 組 0.07 ±0.06 0.15 ±0.47 0.19 ±0.77 0.28 ±0.75 0.38 ±0.15 0.47 ±0.27 0.48 ±0.27 2.879 0.048 D 組 0.17 ±0.04 0.15 ±0.05 0.40 ±0.26 0.45 ±0.37 0.72 ±0.94 0.81 ±0.17 0.77 ±0.10 7.040 0.001

2.2 聯(lián)用效果比較 D組拉帕替尼和順鉑濃度組合 0.05 μmol/L+0.5 μg/L、0.5 μmol/L+1 μg/L、1 μmol/L+2 μg/L、2.5 μmol/L+4 μg/L，q 分別為0.61、0.46、0.74、0.72;而當拉帕替尼和順鉑濃度組合 5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L 時，q 分別為 0.85、0.86、0.85。

3 討論

Guo等［6］研究發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼及5-FU對食管癌細胞有顯著增殖抑制作用，兩者聯(lián)合有協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼、順鉑單藥及聯(lián)用均對Eca109有顯著抑制作用，且隨濃度增加加強。除了當拉帕替尼濃度達到一定程度時，其殺傷作用未見明顯上升，我們推測可能與細胞內(nèi)拉帕替尼達到飽和濃度有關(guān)。在我們實驗的濃度范圍內(nèi)，拉帕替尼與順鉑聯(lián)合并未出現(xiàn)協(xié)同作用，而當拉帕替尼和順鉑濃度組合 5 μmol/L+8 μg/L、12.5 μmol/L+16 μg/L、25 μmol/L+32 μg/L 時，兩者聯(lián)合為相加作用。其機制可能為拉帕替尼將細胞周期阻滯于G0/G期［6］，而順鉑屬于細胞周期非特異性藥物，對增殖細胞各期都有一定的影響。

本研究表明，在取得相同療效的前提下，聯(lián)合應(yīng)用可以減少化療藥物的劑量，并進而可能減少其相應(yīng)的不良反應(yīng)。本研究為食管癌生物化療模式提供一定的依據(jù)，但其具體作用機制及臨床效應(yīng)仍需進一步的研究及更多的臨床循證醫(yī)學證據(jù)。

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