缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織MMP-9、TIMP-1表達變化及意義

梅梅，李慧玲，李春玉，聶磊

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯154002)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)以腦組織水腫、軟化、壞死和出血為主要病變，其中腦水腫包括早期細胞毒性水腫和血腦屏障(BBB)損傷引起的血管源性腦水腫(VBE)［1～3］。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組 Zn2+依賴的金屬蛋白內切酶家族［4］，其中MMP-9的活性受其金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的特異性抑制，二者在成年缺血再灌注腦損傷大鼠VBE的形成中發揮重要作用［5～7］，但二者是否也參與了HIBD新生大鼠VBE的形成，目前國內報道較少。2013年5月～2014年12月，我們建立了新生大鼠HIBD模型，觀察其腦組織MMP-9、TIMP-1表達變化，并探討其與HIBD過程中VBE發病的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 健康7日齡新生Wistar大鼠72只，雌雄各半，體質量雌性230～250 g、雄性310～340 g，購于佳木斯大學實驗動物中心。MMP-9、TIMP-1兔多克隆純化親和抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物制品有限公司。TK-C721EC彩色攝像機購于北京杰偉世視頻設備有限公司，BI-2000病理圖像分析系統購于成都泰盟科技有限公司。

1.2 分組與造模 將72只大鼠隨機分為觀察組和對照組各36只。觀察組吸入乙醚麻醉，仰臥位膠布固定于手術板上，常規乙醇消毒頸部皮膚;頸正中1 cm左右縱形切口，鈍性分離皮下組織和肌肉。游離并暴露左側頸總動脈，以5-0號絲線雙線結扎后剪斷，縫合皮膚，碘伏局部消毒。新生鼠返回母鼠身邊恢復2 h后，置于自制37℃恒溫水浴缺氧艙內;以1～2 L/min持續輸入含8%氧氣、92%氮氣的混合氣體，保持氧濃度為8.0% ±0.5%;2 h后將鼠取出，返回母鼠身邊繼續喂哺。對照組手術分離左側頸總動脈后不結扎，縫合手術切口后返回母鼠身邊喂哺，不予低氧處理。

1.3 標本處理 兩組分別于造模后6 h(T0)、12 h(T1)、24 h(T2)、72 h(T3)、5 d(T4)、7 d(T5)各處死6只，斷頭取腦;以視交叉為切點，冠狀位向后取一片厚約3 mm的組織;經常規甲醛固定、PBS沖洗、梯度乙醇脫水及二甲苯透明后，石蠟包埋切片。剩余腦組織保存待用。

1.4 腦組織病理觀察 取兩組造模后72 h的腦組織切片，常規HE染色，光鏡下觀察病理情況。

1.5 腦組織MMP-9、TIMP-1檢測 采用免疫組化SP法。標本切片常規脫蠟至水，經過氧化氫室溫孵育、蒸餾水沖洗后浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，分別滴加稀釋的一抗、二抗，PBS洗滌，DAB顯色。以PBS代替一抗作為對照，MMP-9、TIMP-1陽性為細胞質染成淺黃色、棕黃色或棕褐色。每張切片400倍下隨機選取不重復的6個視野，計算MMP-9、TIMP-1陽性細胞百分率。

1.6 腦組織含水量檢測 取出剩余腦組織，于電子分析天平稱其濕重;標本置于100℃烤箱中烘干24 h至恒重，再稱其干重。腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重 ×100。

1.7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腦組織病理情況比較 觀察組大腦皮質水腫明顯，細胞變性、壞死，層次混亂;神經元細胞數目減少，細胞外間隙增寬;炎性細胞增多，間質水腫明顯。對照組腦組織細胞形態結構清晰完整，細胞核居中、核仁清楚，神經細胞胞體有突起伸出，間質內未見出血、壞死及水腫。

2.2 兩組各時點腦組織MMP-9、TIMP-1表達及含水量比較 觀察組腦組織MMP-9、TIMP-1表達及含水量均先升高后降低，對照組無明顯變化。觀察組T0～T5時點腦組織MMP-9、TIMP-1表達及含水量均高于對照組，P均＜0.05。見表1。

表1 兩組各時點腦組織MMP-9、TIMP-1表達及含水量比較(n=36， ± s)

表1 兩組各時點腦組織MMP-9、TIMP-1表達及含水量比較(n=36， ± s)

注:與同組T0時點比較，*P＜0.05;與對照組同時點比較，#P＜0.05，##P ＜0.01。

組別 MMP-9(%) TIMP-1(%) 腦含水量(g/100 g)74.17 ±0.92觀察組T0 13.89 ±1.98# 19.58 ±0.70# 79.11 ±3.64#T1 32.56 ±2.81*## 32.43 ±2.30*## 83.42 ±1.74*#T2 42.40 ±3.53*## 27.71 ±1.46*## 85.29 ±2.24*#T3 33.90 ±2.11*## 26.18 ±1.77*## 85.04 ±1.70*#T4 31.55 ±2.13*## 17.59 ±1.66*## 81.34 ±2.38*#T5 2.75 ±0.25＊＊# 7.94 ±0.58*## 76.84 ±2.17*#對照組T0 2.08 ±0.21 1.80 ±0.17 73.74 ±1.89 T1 2.07 ±0.19 1.85 ±0.21* 74.61 ±2.23 T2 2.05 ±0.22 1.90 ±0.17* 74.35 ±1.32 T3 2.18 ±0.30 1.92 ±0.20* 73.48 ±1.82 T4 2.10 ±0.27 1.94 ±0.12* 73.52 ±1.55 T5 2.09 ±0.26 1.97 ±0.19*

3 討論

MMPs在生理條件下主要以無活性的酶原形式存在，在腦缺血及炎癥介質的刺激下可轉化為活性成分［8］。其中，與 BBB破壞關系最為密切的是MMP-9［9，10］，其對于毛細血管基膜的破壞可能是神經炎癥反應所致BBB損傷的一條最終共同通路［11］。Rosenberg等［12］發現，MMP-9 通過降解毛細血管基底膜而破壞BBB，產生繼發性組織損傷，且活性MMP-9的出現與BBB開放時間一致。Gasche、Fujimura 等［13，14］發現，早期活化的 MMP-9 是導致BBB破壞和VBE形成的主要原因。因此，MMP-9激活導致BBB通透性改變，是HIBD過程中VBE形成和繼發性腦損傷的關鍵因素。

TIMP-1可由巨噬細胞、角質細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞合成，是MMPs的內源性組織抑制因子，主要從兩個方面抑制MMPs活性。在酶原活化階段，TIMP可與MMPs形成穩定復合物而阻礙MMP的酶原自我激活;在活化的MMPs階段，可直接與活化的MMPs形成緊密的1∶1復合體而抑制其活性。TIMP-1可與MMP-9特異性結合，形成可溶性非共價復合物，從而在蛋白水平調節其活性。最近研究發現，TIMPs不僅是MMPs抑制劑，還可能在MMPs的激活級聯過程中扮演重要角色。但是，國內對于二者是否參與了缺血性腦血管病后BBB損害和VBE形成，以及在此過程中的變化規律等方面的研究甚少，在新生兒HIBD領域也少有報道。

本研究發現，觀察組大腦皮質水腫明顯，細胞變性、壞死，神經元細胞數目減少，炎性細胞增多;而對照組腦組織細胞形態結構清晰完整，間質內未見出血、壞死及水腫。同時本研究中，觀察組腦組織含水量呈先升高后降低趨勢，各時點腦組織含水量均顯著高于對照組，說明在HIBD過程中有明顯的腦水腫形成。觀察組腦組織MMP-9表達先升高后降低，且時相變化與BBB第二次雙相開放模式的時間一致;說明MMP-9參與了BBB的破壞過程，是VBE形成的主要機制之一。本研究中，觀察組腦組織TIMP-1表達也是先升高后降低，但是與MMP-9表達變化并不完全平行，其高峰時段存在差異，可能與HIBD過程中誘導MMP-9大量表達時TIMP-1的耗竭有關［15，16］。因此，HIBD 新生大鼠腦組織 MMP-9和TIMP-1表達升高，且呈時間依賴性，二者可能與HIBD過程中血管源性腦水腫的形成有關。

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