貴州黑山羊GnRHR基因與繁殖性狀相關性的研究

張勁松 龍威海 許厚強 馮文武 陳祥*

（1，貴州省習水縣農牧局 564600；2，貴州大學動物科學學院貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室 550025）

貴州黑山羊GnRHR基因與繁殖性狀相關性的研究

張勁松1龍威海2許厚強2馮文武2陳祥2*

（1，貴州省習水縣農牧局 564600；2，貴州大學動物科學學院貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室 550025）

研究GnRHR基因SNP與貴州黑山羊繁殖性狀關聯性。試驗采用PCR-SSCP技術檢測GnRHR基因單核苷酸多態性。結果發現，貴州黑山羊GnRHR基因外顯子1檢測到1個SNP位點G121A。基因型與繁殖性狀關聯分析顯示，貴州黑山羊GnRHR基因AA基因型個體產羔數顯著高于與AG和GG基因型個體（P＜0.05）。結果提示：GnRHR基因可能是影響山羊產羔數的主效基因。

GnRHR；基因；遺傳；繁殖性狀；貴州黑山羊

促性腺激素釋放激素受體（Gonadotropin releasing hormone receptor，GnRHR）是垂體促性腺細胞合成的一種高親和G蛋白偶聯受體，在垂體促性腺細胞表面與促性腺激素釋放激素的結合，從而促進促卵泡素和促黃體素的合成和釋放，對動物機體的繁殖進行調控。近年來，把GnRHR基因作為影響動物繁殖性能的候選基因來研究，取得了一系列研究成果。黃楊河[1]等采用PCR-SSCP技術對GnRHR基因在川東白山羊、貴州白山羊和古藺馬羊進行了研究，發現一處堿基突變，且多態性與產羔數顯著相關。國內外對動物和人的GnRHR基因已有報道，但對于貴州黑山羊GnRHR基因多態性的研究尚未見報道。本試驗采用PCR-SSCP及PCR產物直接測序技術對GnRHR基因在貴州黑山羊的多態性位點進行檢測，以探尋GnRHR基因多態性與產羔數之間的相關性，為進一步研究貴州黑山羊繁殖性狀的遺傳機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗均采集具有前3胎產羔記錄的貴州黑山羊102只采自貴州省黔西縣。

1.2 主要實驗試劑

Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒，聚丙烯酰胺凝膠， 瓊脂糖凝膠， 2xEs Taq Master Mix， DM2000，Buffer1xTBE緩沖液均購自貴州鼎國生物工程有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據NCBI中GenBank數據庫中綿羊GnRHR(登錄號：BC120472)基因序列進行引物設計。利用Primier-BLAST在線軟件設計特異性引物，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 SSCP分型及測序

PCR反應程序為95℃ 3min；34個循環（95℃ 30s，表1溫度30s，72℃ 30min）；72℃延伸5min；4℃保存。PCR反應體系為 20μL： 2×Taq PCR Master Mix 10μL， DNA 模板 2μL，上、下游引物各1.5μL，加水至20μL。SSCP所需PCR產物用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。取5μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取7μL的PCR產物和7μL的變性劑，100℃水浴10分鐘后置于-20℃冰箱中20min。點樣完成后先進行250V電壓預電泳30min，后110V電壓進行16h左右電泳，最后經固定、銀染、顯色后進行分辨條帶帶型。選擇條帶單一的PCR產物送交北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。用DNAStar軟件對序列結果進行校正，BLAST分析確定SNPs。

表1 引物相關信息

2 結果與分析

2.1 PCR-SSCP分型及測序

在貴州黑山羊GnRHR-T引物所擴增的PCR產物分別進行SSCP分析，結果顯示擴增序列在貴州黑山羊樣品中均出現3種帶型，純合型定義為AA型和GG型，雜合型定義為AG 型 (圖 1)。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜

選擇貴州黑山羊不同基因型個體PCR產物送交公司測序，通過SepMan程序分析測序結果并比對，在GnRHR基因第1外顯子121bp發生突變，突變前后均未引起氨基酸的改變。

圖2 多態位點測序峰圖

2.2 GnRHR基因SNP位點群體遺傳變異分析

對G121A進行遺傳參數統計，結果見表2。由表可知：貴州黑山羊以AG基因型為優勢基因型，基因型頻率為0.480。優勢等位基因為G，其頻率為0.603。貴州黑山羊群體表現為中度多態（0.25＜PIC＜0.5）。

表2 G121A位點遺傳參數

2.3 GnRHR基因多態性與繁殖性狀關聯性分析

由表3可知，在貴州黑山羊試驗群體中，AA基因型與AG和GG基因型差異顯著（P＜0.05），而AG基因型與GG基因型差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

GnRHR數量的增加能引起LH的高峰，而動物的排卵主要依靠LH高峰。因此，GnRHR基因對動物的繁殖性能起著重要的作用。垂體GnRHR濃度的升高能促進哺乳動物的排卵，而GnRHR的缺失則引起排卵障礙，進而導致不育。近幾年來，對GnRHR基因與繁殖性能的關系展開大量研究。Dun[2]等對母雞群體GnRHR基因檢測，結果發現GnRHR基因對母雞產產蛋數和雙黃蛋分別具有顯性效應和加性效應；柳楠[3]等檢測了GnRHR基因在嶗山奶山羊的單核苷酸多態性，結果顯示該基因A261G突變，對于經產母羊GA型產羔數顯著高于AA型；張育軍[4]等檢測了GnRHR基因外顯1和外顯子2的多態性，發現外顯子2內的突變對于黃淮山羊產羔數BB型比AA型多0.66只，差異顯著；朱廣琴[5]等研究發現GnRHR基因外顯子1存在G→A的突變，在黃淮山羊AA型產羔數高于AG型產羔數；黃楊河[1]等對波爾山羊及其他9個地方山羊品種GnRHR基因多態性進行檢測，發現一個突變位點與本研究的G121A突變位點相同，并且在貴州黑山羊兩個群體中AA基因型個體的產羔數都顯著高于GG和GA基因型。綜上所述，GnRHR基因對影響貴州黑山羊產羔數有一定的影響，可能是影響其產羔性狀的候選基因。

表3 G121A位點不同基因型與不同山羊品種與產羔數的相關分析

[1] 黃楊河,王憑青,楊力,儲明星,張寶云,鄧臘梅,譚穎,樊奇.促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)基因多態性及其與山羊產羔數的相關性分析[J].畜牧獸醫學報,2012(1):22-28.

[2]Dunn I C,Miao Y W,Morris A,et al.A study of association between genetic markers in candidate genes and reproductive traits in one generation of a commercial broiler breeder hen population[J].Heredity,2004,92(2):128-134.

[3]柳楠,馬曉麗,程明,等.GnRHR基因多態性與嶗山奶山羊產羔數的關聯分析[J].華北農學報,2014,29(6):78-83.

[4]張育軍,胡敏蘭,張子軍,丁建平,任春環,楊玉敏,阮崇美.山羊GnRHR基因部分序列多態性及其與產羔數的關聯性分析[J].中國草食動物,2010(4):13-16.

[5]朱廣琴,王慶林,康永剛,等.GnRHR,GDF9,KISS1基因多態性與黃淮山羊產羔性狀相關性的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2013(11):18.

貴州省科技重大專項 [黔科合重大專項字 (2013)6008]。

張勁松（1973-），男，貴州省習水縣人，研究生，主要從事畜牧水產技術推廣。

*通訊作者：陳祥 (1974-)，博士，教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。