豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

譚素媚 聶立欣 付強

（1，廣東省肇慶市農業學校 526070；2，佛山科學技術學院生命科學學院 528231）

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

譚素媚1聶立欣1付強2*

（1，廣東省肇慶市農業學校 526070；2，佛山科學技術學院生命科學學院 528231）

豬傳染性胸膜肺炎是一種高度傳染性呼吸道疾病，影響全球養豬業的發展。本研究采用多種培養基進行接種培養，從具有豬傳染性胸膜肺炎臨床癥狀病死豬的肺臟和胸腔滲出液分離到革蘭氏陰性桿菌，通過細菌分離、涂片染色鏡檢、衛星現象試驗、V因子依賴性試驗診斷，最終確定所分離的細菌為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。通過藥敏實驗發現該分離菌對氟苯尼考、強力霉素和先鋒Ⅵ等藥物高度敏感，研究結果為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌病的診斷及治療提供指導意義，同時也為進一步研究豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的致病機理奠定基礎。

豬；傳染性胸膜肺炎放線桿菌；病原分離鑒定；藥敏試驗

豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病。該病主要表現為急性出血性纖維素性肺炎、慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎，急性發病死亡率高，是當今危害養豬業的一種重要細菌性疾病[1]，嚴重危害著我國養豬業的發展。

在規模化養豬場中，豬傳染性胸膜肺炎容易引起群發性死亡，造成較大損失[2]。2014年10月，廣東省肇慶某豬場3月齡的豬發病并出現大量死亡。臨床主要表現為被毛松亂、體溫升高，耳、鼻及四肢皮膚呈藍紫色，咳嗽、呼吸極度困難，有的呈犬坐姿勢，臨死前口鼻孔流出血色或白色的泡沫。剖檢見胸腔含有粉紅色液體，心包積液，纖維素性心包炎，纖維素性腹膜炎、肺炎，胸壁和肺粘連很嚴重。為更好的控制該病，本實驗通過病原分離鑒定確定細菌，并以此為依據做藥物敏感性試驗，提出合理的防治方案。

1 材料和方法

1.1 試劑和培養基

生化微量鑒定管、培養基、藥敏紙片等均購于廣州瑞舒生物科技公司；金黃色葡萄球菌及V因子（NAD，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）為佛山科學技術學院預防獸醫實驗室保存。

1.2 V因子需要試驗

分離菌株分別接種于含有終濃度為0.01%V因子和無V因子的普通營養肉湯中，在37℃需氧和厭氧條件下培養24～48h后，觀察和記錄試驗結果。

1.3 衛星現象試驗

將鮮血瓊脂培養基劃線接種金黃色葡萄球菌并垂直劃線分離的細菌，37℃培養24～48h。

1.4 生化鑒定

用分離菌純培養物進行下列試驗：硝酸鹽還原、尿素酶、靛基質、MR、VP試驗、葡萄糖、乳糖、硫化氫、接觸酶、水楊苷、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、果糖、木糖、檸檬酸鹽、山梨醇等糖發酵試驗[3]。接種前在發酵管中加入2μL的1%的NAD。

1.5 藥敏實驗

蘸取分離菌的肉湯培養物，接種于血瓊脂平板，將各種藥敏紙片分別平貼于培養基表面，37℃培養24h，測定抑菌環。

2 結果

2.1 鏡檢結果

病料接種于巧克力培養基，37℃培養發現菌落為露珠狀、約2～3mm大小，閃光不透明。經革蘭氏染色，可見革蘭氏陰性球桿菌，菌體細小，也可見桿狀、絲狀散在菌體（見圖1）。

2.2 細菌分離培養特征

在普通平板、麥康凱培養基上不生長；在巧克力培養基上長成針尖大、灰白色、圓形隆起、閃光不透明的菌落；在鮮血瓊脂培養基上長成更細小的透明菌落，密集時可看到形成一片β溶血區；挑取菌落染色鏡檢，符合豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的形態和染色特征。對比兩種營養肉湯的渾濁度發現，添加了V因子的肉湯比不添加V因子的肉湯渾濁（見圖2），生長更旺盛，表明該分離菌生長依賴V因子。

圖1 分離細菌的顯微形態（10×100，革蘭氏染色）

衛星現象：普通瓊脂平板上金黃色葡萄球菌線兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，離金黃色葡萄球菌越近菌落越大，越遠菌落越小，遠離葡萄球菌的地方甚至不生長，呈現出明顯的 “衛星現象”。在分離菌和金黃色葡萄球菌的分界線處出現明顯的溶血現象，表明分離菌與金黃色葡萄球菌具有協同溶血的作用。

圖2 分離菌在營養肉湯培養基的生長情況

2.3 生化試驗結果

由表1可知，分離菌能發酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖和麥芽糖等；脲酶試驗陽性，接觸酶陽性，硝酸鹽還原試驗陽性。

表1 分離菌的生化實驗結果

2.4 藥物敏感試驗結果

試驗結果表明，該菌對氟苯尼考、強力霉素、頭孢唑啉、環丙沙星、壯觀霉素、阿米卡星、鏈霉素、先鋒Ⅵ、哌拉西林、諾氟沙星、頭孢拉定高度敏感；對紅霉素、四環素中度敏感；對卡那霉素芐青霉素、慶大霉素為低度敏感，對氨芐西林、青霉素為耐藥（見表2）。

表2 分離菌的藥敏試驗結果

3 討論

本研究從肇慶市某豬場采集病料，發現分離菌為需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性短桿菌、球桿菌，偶爾有長絲狀的多種形態細菌；營養需求較高，生長依賴V因子，在巧克力瓊脂培養基上為透明的粘液型菌落等培養特性與大多APP報道的特性一致[4，5]。生化試驗發現尿素酶、V因子依賴性、溶血性和木糖為陽性與標準菌株的指標一致。分離菌株大多數生化特性符合前人研究胸膜肺炎放線桿菌的結果，僅有幾項指標與前期資料所介紹的不一致，可能由于APP營養要求較高而常規的生化發酵管營養成分不足或較低導致發酵遲緩，甚至出現假陰性。結合發病豬群的流行病學特征、臨床癥狀、病死仔豬的組織病理變化和實驗室檢驗結果，推測此分離菌為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌。此類胸膜肺炎放線桿菌屬于生物Ⅰ型，即依賴V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD輔酶）生長的原胸膜肺炎嗜血桿菌。進一步對分離菌株進行血清型鑒定和致病力研究，將有助于闡明豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的致病機制。

分離菌對氟苯尼考、強力霉素和先鋒Ⅵ高度敏感（這三種抗菌素被推薦為臨床用藥），對四環素、鏈霉素等藥物敏感低，青霉素等不敏感，表明大多數藥物對胸膜放線桿菌敏感性不高，也有可能是與這些藥物在豬場的使用頻率高有關。由于本病的蔓延流行和抗菌藥物的長期應用，出現較多的耐藥菌株，因此采用藥物治療時最好進行藥敏試驗，根據藥敏試驗結果，選擇有效敏感藥物進行治療，才可獲得較好的效果。防治本病除了使用較敏感的抗生素外，還應進行定期的免疫接種，加強飼養管理，應避免豬群擁擠，加強通風。這次在肇慶豬場發生這種疾病，可能就是由于氣候條件的改變所引起，是否與血清型有關需要進一步的研究。

[1]厚華艷,梁武,呂茂杰,楊保收,等.豬傳染性胸膜肺炎亞單位疫苗研究進展[J].動物醫學進展,2015,36（2）:84-88.

[2]Frey J,Beck M,Nicolet J,Toxin typing of action-bacillus pleurpneumoniae by PCR[J].Veterinary Bulletin,1996,66（8）:5109.

[3]姚火春.獸醫微生物學實驗指導（第2版）[M].北京:中國農業出版社,2002.

[4]劉春花,張彥明,等.胸膜肺炎放線桿菌研究進展[J].中國獸醫學報,2003,23（2）:206-208.

[5]張彥明,劉春花,等.胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及免疫預防[J].中國獸醫科技,2002,32（5）:21-22.

廣東省自然科學基金項目（2014A030310020）和廣東高校優秀青年創新人才培養計劃項目（2014KQNCX179）資助。

付強（1983-），男，博士，研究方向為臨床獸醫學。