小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動物模型的構建

李潤祥 馮承恩 梁碧華 田歆 朱慧蘭

小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動物模型的構建

李潤祥 馮承恩 梁碧華 田歆 朱慧蘭

目的 建立小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動物模型。方法 將60只BALB/c小鼠隨機分5組：抗二硝基苯酚IgE單克隆抗體（抗DNP IgE）+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組小鼠尾靜脈注射抗DNP IgE，24 h后分別在小鼠耳部涂DNFB和TMA；DNFB組、TMA組、生理氯化鈉液（NS）組小鼠尾靜脈注射NS，24 h后分別在小鼠雙耳涂DNFB、TMA、NS，觀察小鼠在14 d內的風團、瘙癢情況、肥大細胞脫顆粒數、脾臟指數和皮膚病理。結果 抗DNP IgE+DNFB組全部（12/12）和抗DNP IgE+TMA組部分小鼠（8/12）產生風團；抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的搔抓次數［30 min時分別為（31.58±3.58）次/h，（22.17±3.81）次/h］、肥大細胞脫顆粒率［（70.21±26.01）%，（54.25±39.57）%］及脾臟指數（7.54±1.56，7.87±1.18）與 NS組［（2.00± 0.85）次/h，（14.45± 6.79）%，5.37± 1.16］相比均顯著增加（F值分別為 437.86、14.41、4.29，均P＜0.01）；DNFB組、TMA組及NS組均無風團產生。結論 通過抗DNP IgE誘導及DNFB激發后可快速、較穩定地建立小鼠免疫性接觸性蕁麻疹動物模型。

蕁麻疹；疾病模型，動物；小鼠；皮炎，變應性接觸性；二硝基苯類；二硝基氟苯

蕁麻疹發病機制尚不清楚，目前治療仍棘手，實驗研究與缺乏理想的動物模型有關，因此建立蕁麻疹動物模型對蕁麻疹的研究具有重要意義。在蕁麻疹的模型研究中，Lahti等［1］以二甲亞砜或桂皮酸涂抹豚鼠耳廓兩面，構建了非免疫性接觸性蕁麻疹。Lauerma 等［2］用偏苯三酸酐（trimellitic anhydride，TMA）誘發BALB/c小鼠接觸性蕁麻疹時發現，有免疫性接觸性蕁麻疹發病機制的存在。其他蕁麻疹動物模型研究主要采用注射組胺或建立被動皮膚過敏試驗或建立Ⅰ型變態反應模型，但這些方法建立的動物模型只能模擬蕁麻疹的部分臨床表現。我們在研究皮膚三相過敏反應時發現昆明小鼠背部出現風團樣的皮損，考慮此反應可能會引起蕁麻疹，遂采用抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE單克隆抗體致敏敏感性更高的BALB/c小鼠，并用2,4二硝基氟苯（DNFB）激發以構建免疫性接觸性蕁麻疹模型。考慮到DNFB和TMA均是小分子致敏物質，可誘發哮喘、接觸性皮炎等過敏反應，有時會把兩者放在一起研究［3］，且 TMA 也可能會誘發蕁麻疹［2］，故將其一起研究。

資料與方法

一、資料

60 只 BALB/c小鼠，雌雄各半，（20± 2）g，購自南方醫科大學實驗動物中心，SPF級，動物合格證號44002100001315。抗DNP IgE單克隆抗體、TMA（美國Sigma-Aldrich公司）；DNFB（成都格雷西亞化學技術有限公司）。

二、方法

1.分組及造模：將小鼠隨機分成5組，每組各12只，每組預先背部去毛2 cm×3 cm，參考三相反應的造模方法［4］。抗 DNP IgE+DNFB 組、抗 DNP IgE+TMA組小鼠尾靜脈各注射1∶5 000抗DNP IgE單克隆抗體0.5 ml，DNFB組、TMA組、生理氯化鈉液（NS）組小鼠尾靜脈各注射NS 0.5 ml。24 h后，分別在抗DNP IgE+DNFB組、DNFB組小鼠雙耳各涂0.15%DNFB 50 μl進行激發，抗DNP IgE+TMA組、TMA 組小鼠耳部各涂 500 g/L TMA 50 μl，NS 組涂NS，隨后放入小鼠透明觀察籠。激發14 d后處死小鼠，實驗期間小鼠正常飲食。

2.觀察指標：①一般情況：每天觀察記錄小鼠一般情況；②風團：尾靜脈注射伊文思藍后采用自動定時拍照，每30分鐘拍攝1次，記錄小鼠背部暴露部位風團數量、次數、大小、消退時間；③小鼠搔抓行為：于激發前和激發后0.5、12 h及以后14 d每天定時持續拍攝小鼠活動10 min，錄像回放，統計搔抓次數［5］；④脾臟指數：剝離脾臟，稱重，計算方法為：脾臟指數（mg/g）= 脾臟重量（mg）/小鼠體重（g）［6］；⑤肥大細胞脫顆粒率：小鼠處死后，腹腔注射臺氏液（含肝素）兩次，每次間隔2～3 min，輕揉腹壁10 min，將腹腔內容物推向一側，吸出腹腔液，置于涂有硅油的試管中。671×g離心，棄上清液，將沉淀物重新混在2 ml臺氏液，配制成106肥大細胞懸液，各管加臺氏液至0.9 ml，37℃水浴5 min，輕搖勻，再水浴15 min后冰浴。吸取試管內懸液2滴，滴于載玻片上與中性紅染料混勻，在×100倍顯微鏡下計數100個肥大細胞，計算2次取平均值。肥大細胞脫顆粒率（%）=脫顆粒肥大細胞/肥大細胞總數×100%；⑥組織病理：處死小鼠后，切下皮損組織用4%甲醛液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。參考蕁麻疹的診斷標準，以反復發作的風團、瘙癢為造模成功的參考標準。

3.統計分析：數據處理應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料的數據結果以±s表示，統計分析采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較方差齊時采用LSD法，不齊時用Dunnetts T3，統計分析風團和搔抓行為時采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般情況

與DNFB、TMA、NS組相比，抗 DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠在激發24 h后精神狀態較差，活動減少，毛色較為零亂，食量明顯減少，排泄物明顯減少，睡眠時間明顯減少。與NS組比較，抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠在第6天到第8天體重增長明顯減緩甚至下降，抗DNP IgE+DNFB組、抗DNP IgE+TMA組和NS組第7天體重增長率分別為（4.6±3.6）%、（5.8 ± 3.6）%、（12.7 ± 7.0）%，DNP IgE+DNFB 組、抗DNP IgE+TMA組與NS組相比，組間差異有統計學意義（F值分別為 2.9、3.1，P分別為 0.002、0.006）。

二、風團情況

激發24 h后，抗DNP IgE+DNFB組中全部小鼠（12/12）和抗DNP IgE+TMA組中8只小鼠（8/12），背部脫毛區相繼出現數量不等的風團，尾靜脈注射伊文思藍后小鼠背部可以見到明顯的藍色斑，稍隆起。抗DNP IgE+DNFB組風團直徑約0.1～0.3 cm大小，抗DNP IgE+TMA組風團直徑約為0.1 cm大小，風團3～4 h消退，但反復發作，抗DNP IgE+DNFB組風團出現次數大于抗DNP IgE+TMA組（F＝7.79，P＝0.011）。而 DNFB、TMA、NS組均未見風團（圖1）。抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組小鼠的風團均在第3天達到高峰，分別達9.8±1.1次和5.8±4.4次，后緩慢減少（圖2）。

三、搔抓行為

與NS組比較，各組小鼠的在造模后的搔抓次數均顯著升高（F值為437.86，均P＜0.01），其中抗DNP IgE+DNFB組升高最明顯，抗DNP IgE+TMA組次之，DNFB組與TMA組組間無明顯差別。各組小鼠的搔抓次數均在造模后30 min出現高峰，在第7天，抗DNP IgE+DNFB組小鼠的搔抓次數出現另一個峰值（圖3）。

圖1 小鼠背部風團情況 1A：抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組（左）和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）小鼠（右）背部出現藍斑，抗DNP IgE+DNFB組藍斑量較多（箭頭）；1B：生理氯化鈉（NS）組（左）背部未出現藍斑，抗DNP IgE+DNFB組（右）小鼠背部出現藍斑；1C，1D：DNFB組和TMA組背部未出現藍斑

圖2 抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組造模后風團發生次數，均在第3天達高峰，隨后逐漸下降。DNFB組、TMA組及生理氯化鈉（NS）組均無風團產生，重合為一條線（下方紅線）

四、脾臟指數

與NS組比較，抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組差異有統計學意義（P＜0.05）。其余各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 實驗各組小鼠的脾臟指數和肥大細胞脫顆粒情況

五、肥大細胞脫顆粒測定

抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組的肥大細胞脫顆粒率均明顯高于NS組（均P＜0.01），抗DNP IgE+DNFB 組也顯著高于DNFB組（P＜0.01），抗DNP IgE+TMA組顯著高于TMA組（P＜0.01），抗DNP IgE+DNFB組和抗DNP IgE+TMA組之間差異無統計學意義；DNFB組、TMA組及 NS組之間差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表1。

六、組織病理

抗DNP IgE+DNFB組小鼠皮膚組織表皮正常，真皮水腫、膠原束距離增寬，血管周圍稀疏炎癥細胞浸潤；抗DNP IgE+TMA組部分真皮水腫；DNFB組、TMA組及NS組小鼠表皮正常，膠原纖維排列整齊，無卷曲斷裂，無明顯炎癥細胞浸潤（圖4）。

討 論

圖3 各組造模后搔抓行為的改變。造模后抗二硝基苯酚（抗DNP）IgE+二硝基氟苯（DNFB）組和抗DNP IgE+偏苯三酸酐（TMA）組搔抓行為明顯增加，DNFB組、TMA組早期有所增加，生理氯化鈉（NS）組無改變

蕁麻疹主要表現為風團和瘙癢，自發或誘導，發病機制十分復雜，仍未完全清楚。接觸性蕁麻疹在誘導部分中占相當大部分，主要表現為接觸致敏物后出現皮膚發紅、風團、瘙癢。接觸性蕁麻疹還可再分為免疫性和非免疫性。免疫性接觸性蕁麻疹的皮疹可以局限于接觸部位，也可以累及未接觸部位，甚至泛發全身，并伴有呼吸道、消化道及眼結膜等系統受累［7］。

DNFB致敏后可產生抗DNP-IgE抗體，注射抗DNP-IgE抗體可引起皮膚肥大細胞被動致敏［8］。本實驗結果顯示，利用抗DNP IgE單克隆抗體致敏，再用DNFB激發，可以使BALB/c小鼠產生風團、瘙癢等癥狀，符合蕁麻疹臨床特征，病理檢查可見到風團處的真皮部位出現明顯水腫，真皮膠原束間距離增寬，血管周圍稀疏炎細胞浸潤，符合蕁麻疹的病理特征。致敏后利用TMA激發也可以誘發部分的小鼠出現蕁麻疹，而單純單次外用DNFB、TMA則未能誘發蕁麻疹，僅早期瘙癢增加。本實驗結果提示，抗DNP IgE單克隆抗體能明顯提高BALB/c小鼠對抗原的敏感性。

另外，實驗結果還發現風團的發生次數及搔抓次數與三相過敏反應不一致。抗DNP IgE誘導的皮膚三相過敏反應，在激發后1 h，24 h和8 d耳廓處分別出現速發相、遲發相、超遲發相反應［4］，而本實驗IgE誘導再激發后背部風團的發生次數及搔抓次數均未見三相反應，僅抗DNP IgE+DNFB組的搔抓次數在第7天時可見第二個峰值，但此峰值比第一峰值明顯下降，而皮膚三相過敏反應中第8天時耳廓的腫脹度是逐步增多的［4］。本實驗結果提示，利用抗DNP IgE單克隆抗體致敏，再用DNFB或TMA激發，可以在BALB/c小鼠身上復制出蕁麻疹動物模型。

本實驗中抗DNP IgE+DNFB組全部小鼠出現風團，而抗DNP IgE+TMA組約三分之二小鼠出現風團，且抗DNP IgE+DNFB組在風團數與風團大小均大于抗DNP IgE+TMA組，說明在抗DNP IgE致敏的條件下，DNFB造模的效果優于TMA。由于風團出現在激發部位以外的地方，且是接觸誘發，故本次蕁麻疹的動物模型考慮為免疫性接觸性蕁麻疹動物模型。另外，抗DNP IgE+DNFB組出現Ⅰ型和Ⅳ型變態反應，與接觸性蕁麻疹相似［9］。風團是毛細血管通透性增加的一種表現，毛細血管通透性增加的檢測常用伊文思藍染色后用染料的提取或測量局部皮下變藍直徑的方法，盡管它們有良好的復制率的優點，但較復雜、費時，并且需要特殊的裝置，因此沒有得到廣泛的應用［10］。本實驗通過伊文思藍染色后再在皮膚表面觀察風團的方法，雖粗略，但較省時省力，且符合蕁麻疹風團的動態變化的觀察。

我們近期發現蕁麻疹與Th17/Treg細胞表達失衡［11］、凝血系統激活等有關［12］，但仍認為，肥大細胞和（或）嗜堿性粒細胞的激活和脫顆粒是蕁麻疹發病機制的中心環節［13］。誘導肥大細胞活化并脫顆粒的機制包括免疫性、非免疫性和特發性。肥大細胞可被DNFB激活，DNFB和TMA外涂小鼠耳部都可以誘導IgE抗體的產生，引起肥大細胞脫顆粒［14］。在抗DNP IgE聯合DNFB誘導三相反應時，肥大細胞在速發相中發揮主要作用，在超遲發相中和T細胞發揮作用［4］。本實驗中，抗 DNP IgE+DNFB 組、抗DNP IgE+TMA組小鼠的肥大細胞脫顆粒細胞率明顯高于NS組（P＜0.01），提示此方法能激發小鼠激活肥大細胞脫顆粒，使小鼠體內出現高敏狀態，出現免疫內環境的改變。估計其激活的原因早期與IgE升高有關，后期則與繼發的炎癥介質有關，此與蕁麻疹的發病機制相符［13］。

在反應免疫情況中，還可以通過脾臟指數來反映。脾臟作為機體最大的外周免疫器官，當免疫系統收到刺激時，脾臟的重量有一定的增生［6］。本實驗中，抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組的脾臟指數與NS組比較均明顯增高，但其余各組間差異無統計學意義（P＜0.05）。可見造模過程中，抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的免疫器官受到了一定的影響。此結果提示脾臟參與了抗DNP IgE+DNFB組及抗DNP IgE+TMA組小鼠的免疫反應。

Lauerma 等［2］用 TMA 誘發 BALB/c 小鼠接觸性蕁麻疹時僅發現部分為免疫性接觸性蕁麻疹。相比其他注射組胺或建立被動皮膚過敏試驗或Ⅰ型變態反應模型，本實驗更接近臨床真實情況，但操作比較復雜，有待進一步改進。

［1］Lahti A,Maibach HI.An animal model for nonimmunologic contact urticaria［J］.Toxicol Appl Pharmacol,1984,76（2）：219-224.

［2］Lauerma AI,Fenn B,Maibach HI.Trimellitic anhydride-sensitive mouse as an animal model for contact urticaria［J］.J Appl Toxicol,1997,17（6）：357-360.

［3］Ban M,Langonne I,Goutet M,et al.Simultaneous analysis of the local and systemic immune responses in mice to study the occupational asthma mechanisms induced by chromium and platinum［J］.Toxicology,2010,277（1-3）：29-37.

［4］劉繼勇,胡晉紅,朱全剛,等.鹽酸西替利嗪對IgE誘導的皮膚三相過敏反應P物質表達的影響［J］.藥學學報,2005,40（7）：649-653.

［5］Fujii M,Shimizu T,Nakamura T,et al.Inhibitory effect of chitosancontaining lotion on scratching response of hairless mice with atopic dermatitis-like dry skin［J］.Biol Pharm Bull,2011,34（12）：1890-1894.

［6］Deng YY,Yi Y,Zhang LF,et al.Immunomodulatory activity and partialcharacterisation ofpolysaccharides from Momordica charantia［J］.Molecules,2014,19（9）：13432-13447.

［7］鄒穎,王學民.職業性接觸性蕁麻疹的研究進展［J］.國際皮膚性病學雜志,2011,37（5）：294-297.

［8］Inagaki N,Nagai H.Analysis of the mechanism for the development of allergic skin inflammation and the application for its treatment：mouse models for the development of remedies for human allergic dermatitis［J］.J Pharmacol Sci,2009,110（3）：251-259.

［9］Lakshmi C.Allergic contact dermatitis（type IV hypersensitivity）and type I hypersensitivity following aromatherapy with ayurvedic oils （dhanwantharam thailam,eladi coconut oil） presenting as generalized erythema and pruritus with flexural eczema［J］.Indian J Dermatol,2014,59（3）：283-286.

［10］Nidavani R B,Am M,Shalawadi M.Vascular permeability and Evans blue dye：a physiological and pharmacological approach［J］.J App Pharm Sci,2014,4（11）：106-113.

［11］朱慧蘭,楊婧,李潤祥,等.慢性特發性蕁麻疹患者相關轉錄因子FOXP3、RORγt基因的表達失衡［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（1）：53-54.

［12］梁碧華,李潤祥,林路洋,等.慢性蕁麻疹發作期與緩解期凝血狀態、補體以及炎癥標志物水平的改變［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（1）：30-32.

［13］中華醫學會皮膚性病學分會免疫學組.中國蕁麻疹診療指南（2014 版）［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（7）：514-516.

［14］Dudeck A,Dudeck J,Scholten J,et al.Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens［J］.Immunity,2011,34（6）：973-984.

2014-09-15）

（本文編輯：吳曉初）

Establishment of a mouse model for immunological contact urticaria

Li Runxiang*,Feng Cheng′en,Liang Bihua,Tian Xin,Zhu Huilan.*Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China

Zhu Huilan,Email：zhlhuilan@hotmail.com

ObjectiveTo establish an animal model for immunological contact urticaria in mice.MethodsA total of 60 BALB/c mice were randomly and equally divided into 5 groups：anti-dinitrophenol IgE monoclonal antibody（anti-DNP IgE）+2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）group and anti-DNP IgE+trimellitic anhydride（TMA）group both injected with anti-DNP IgE via tail veins firstly,followed by topical treatment with DNFB and TMA respectively on the ears at 24 hours after the injection,DNFB group,TMA group and normal saline （NS）group all injected with NS via the tail vein firstly,followed by topical treatment with DNFB,TMA and NS on the ears 24 hours after the injection.In the following 14 days,mice were observed daily for the appearance of wheals and for scratching behavior.All the mice were sacrificed at the end of the study followed by determination of the percentage of degranulated mast cells and spleen index as well as observation of pathological changes.ResultsWheals were observed in all the mice （12/12）in the anti-DNP IgE+DNFB group,some mice （8/12）in the anti-DNP IgE+TMA group,but not observed in any mice in the other 3 groups.Compared with the NS group,both the anti-DNP IgE+DNFB group and anti-DNP IgE+TMA group showed a significant increase in the percentage of degranulated mast cells（70.21%±26.01%and 54.25%±39.57%vs.14.45%±6.79%,F=14.41,P=0.000）,spleen index（7.54±1.56 and 7.87±1.18 vs.5.37±1.16,F=4.29,P=0.004）and scratching frequency（（31.58 ± 3.58）/h and（22.17 ± 3.81）/h vs.（2.00 ± 0.85）/h at 30 minutes，F=437.86,P＜ 0.01）.ConclusionA stable mouse model for immunological contact urticaria can be established quickly by sensitization with anti-DNP IgE and challenge with DNFB.

Urticaria;Disease models,animal;Mice;Dermatitis,allergic contact;Dinitrobenzenes;Dinitrochlorobenzene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.015

廣東省自然科學基金（S2012020011077）；廣東省醫學科研基金（A2013543）；廣州市醫藥衛生科技項目（20131A011126）

510095廣州市皮膚病防治所（李潤祥、梁碧華、田歆、朱慧蘭）；廣東藥學院醫院化工學院（馮承恩）

朱慧蘭，Email：zhlhuilan@hotmail.com