雙信號放大的酶聯免疫吸附測定新方法研究及應用

張愛紅，林虹君，任勇濤

1.防化學院，北京 102205；2.空軍防化大隊，北京 102206

1971 年瑞典學者Engvall 和Perlmann[1]、荷蘭學者van Weerman 和Schuurs[2]分別報道了將免疫技術發展成為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA 是在免疫酶技術基礎上發展起來的新型免疫測定技術，通過多年來的不斷改進，現已成為一種有效的生化分析方法，并廣泛應用于醫學、生物學等領域[3]。但隨著研究的不斷深入，人們對痕量，甚至超痕量樣本的測定越來越多，這對ELISA 的檢測限提出了新的、更高的要求。另外，ELISA 的影響因素較多，容易造成結果失真，時間和操作要求非常嚴格，對于陽性的區別比較模糊，有時候需要反復實驗等。這些因素的存在都大大限制了其應用。

鑒于目前存在的局限性，我們在傳統ELISA 方法中引入了納米金粒子（Au nanoparticles，AuNPs）和氧化石墨烯（graphene oxide，GO）。由于這兩種材料都具有制備過程簡單、比表面積大、易與蛋白質結合、能保持抗體生物活性等優點，在生物學領域得到了廣泛應用[4-5]。本研究旨在通過抗體功能化的AuNPs 和GO 的引入，逐級放大檢測信號，以減低ELISA的檢測限，擴大該方法的適用范圍和領域。

1 材料與方法

1.1 材料

谷胱甘肽S 轉移酶（GST）、GST-Ab1、HRP-Ab2（購自北京康為試劑公司）；聚二甲基氯化銨（PDDA，20%，Mr：200 000～350 000）、牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-3-（3-二甲基氨）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（購自Sigma-Aldrich 公司）；石墨（美國Alfa Aesar公司）；氯金酸（HAuCl4·4H2O，南京市威圣化工貿易有限公司）；檸檬酸鈉（上海創順化工有限公司）；KH2PO4、Na2HPO4、KCl、Tween-20（購自北京化學試劑公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

Milli-Q 型密理博純水儀（≥18 MΩ，美國Millipore公司）；Tecnai G2 20型透射電鏡（FEI香港有限公司）；PHI 5000C ESCA 型X 線光電子能譜儀（美國RBD公司）；85-2數顯型恒溫攪拌器（國瑞試驗儀器廠）；SORVSLL 型LEGEND MICRO 17 centrifrige（Therno 公司）；Dimension V 型原子力顯微鏡（美國Veeco公司）。

1.2 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的制備

將1 mL 濃度為10 g/L 的氯金酸溶液加入100 mL雙蒸水中，加熱至沸騰，然后迅速加入2.5 mL濃度10 g/L 的檸檬酸鈉溶液，充分攪拌，保持沸騰15 min。這期間溶液顏色依次由灰變藍再變紫，最后為酒紅色。移去熱源，自然冷卻至室溫，即制得平均粒徑為16 nm 的金顆粒，4℃保存備用[6]。納米金在制備過程中，要保證所用玻璃器皿的絕對清潔，首先將所用器皿用王水（濃HNO3∶濃HCl=1∶3）浸泡過夜，然后用雙蒸水沖洗3 次，烘干待用。在加入檸檬酸鈉后要充分攪拌，以免形成的納米金顆粒聚集。在納米金與抗體結合后，要用錫箔包裹避光保存，以避免該結合體見光解離，最好現用現配。

在制備AuNPs 的基礎上，將0.3 mg GST-Ab1加入pH6.0 的納米金溶液中，室溫下攪拌2 h；然后加入2 mL 濃度為10 g/L 的BSA 溶液，室溫封閉30 min；13 300 r/min 離心10 min，溶液分成上、下兩層，上層為沒有結合的抗體，下層為黑色、松軟的結合物；除去上清，用含10 g/L BSA 的PBS 緩沖液（pH7.2～7.4）將產物（AuNPs-GST-Ab1）洗滌并離心3 次，最后溶于PBS 中，置于4℃備用，該產物能在一個月內保持活性[7]。

1.3 GO和GO-Ab2的制備

圖1 AuNPs（A）和AuNPs-GST-Ab1（B）的透射電鏡圖

石墨烯，又稱單層石墨或二維石墨，是單原子厚度的二維碳原子晶體，被認為是富勒烯、碳納米管和石墨的基本結構單元。石墨烯因具有大的比表面積、突出的導熱性能和力學性能及非凡的電子傳遞性能等一系列優異性質，被業內人士廣泛關注[8-11]。制備GO 的方法很多，而將石墨氧化成氧化石墨，再在超聲條件下得到單層的GO溶液，已成為GO制備的有效途徑[12]。具體步驟如下：首先將0.5 g石墨粉末和0.5 g硝酸鈉加入23 mL預冷的濃硫酸中，攪拌反應10 min；然后緩慢加入4 g高錳酸鉀，35℃反應1 h；再向反應體系中緩慢加入40 mL 蒸餾水，95℃反應1 h，加入100 mL 蒸餾水終止反應；然后加入2 mL 濃度為30%的H2O2，室溫反應2 h，將產物離心，并用1 L的HCl（5%）洗滌，隨后用4 L蒸餾水洗滌，離心并再次洗滌；將得到的產物于40℃真空干燥48 h，即為GO粉末，置于4℃備用。

將50 mg NaOH 和ClCH2COONa 加入1 mL 濃度為1 mg/mL的GO溶液中，超聲波裂解1.5 h；將產物GO-COOH 用雙蒸水洗滌3 次，除去過量的堿；將400 mmol/L EDC 和200 mmol/L NHS 一起加入1 mL MES緩沖液（pH6.0）中反應30 min；將混合物于13 300 r/min 離心5 min，除去上清，此過程重復3次；將得到的GO-Ab2 溶于含有10 g/L BSA 的1.0 mL PBS（pH7.4）中，置于4℃備用[8]。

2 結果和討論

2.1 AuNPs與AuNPs-GST-Ab1的表征

圖1A為AuNPs 的透射電鏡圖，圖1B為AuNPs-GST-Ab1 的透射電鏡圖。可以看出，AuNPs 為黑色球狀物，粒徑為16 nm。AuNPs 與GST 的抗體結合后，形成包裹黑色AuNPs顆粒的絮狀物。

2.2 GO與GO-Ab2的表征

圖2A 為GO 的透射電鏡圖，圖2B 為GO-Ab2 的透射電鏡圖，上面的黑色斑點為結合在GO片上的抗體。為保證GO與二抗的結合率，又不破壞抗體的活性，在由石墨制備得到GO 后，要用去離子水透析GO-COOH懸浮液48 h以上，以除去所有離子，因為雜質粒子的存在對GO 與抗體的結合會產生非常不利的影響；然后將GO、EDC、NHS 和MES 緩沖液混合，反應30 min，此時加入的EDC要過量，因為EDC遇水迅速發生水解，量太少不能發揮縮合的作用。

圖2 GO（A）和GO-Ab2（B）的透射電鏡圖

2.3 ELISA應用

將抗體功能化的納米金和GO 用于ELISA 試驗。首先將GST附著在固相載體上，形成固相抗原，洗滌除去未結合的蛋白質及雜質；然后加GST-Ab1與37℃撫育2 h，使抗體和GST結合形成抗原-抗體復合物；洗滌除去未結合物質；加入酶標抗體（HRPAb2），37℃撫育1 h，使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合；洗滌未結合的酶標抗體；此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關；最后加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產物；通過酶標儀讀數，測知GST 的量。ELISA 方法的操作流程如圖3所示。

圖3 改進的ELISA（B）與傳統方法（A）對比示意圖

在A 路線中，每一個GST 分子只能結合一個對應的一抗，而每個一抗也只能結合一個二抗和HRP；而在改進后的B 路線中，每個GST 分子與結合在納米金顆粒上的多個（假定為x個，則x＞1）一抗中的一個結合，而其余一抗又可以和GO 上的二抗結合，通過GO 的連接作用，每個二抗可以和多個（假定為y個，y＞1）HRP 形成結合體，通過納米金和GO 的2 次串聯放大作用，能夠將較小的GST信號逐級放大，提高了檢測的靈敏度。

圖4 改進后（A）與改進前（C）ELISA結果對比圖B、D為陽性對照

為了考察改進后ELISA 方法的性能，用抗體功能化的納米金顆粒和GO 對GST 進行檢測。在圖4中，A 和C 行對應的GST 濃度和稀釋方法（依次1/3梯度稀釋）完全相同，其中A 行使用AuNPs-Ab1 和GO-Ab2-HRPs，C 行使用傳統的Ab1 和Ab2-HRP，其余實驗因素完全相同。結果表明，對抗體功能化修飾后，ELISA 的檢測限從1.62 μg/mL 降低至0.02 μg/mL，檢測能力擴大了81 倍。所以，用納米金和GO功能化修飾后的抗體分別代替傳統抗體，可以有效地降低檢測限。多次試驗結果表明該方法穩定，重復性好，可對樣本中低濃度蛋白質進行靈敏檢測。

綜上，通過AuNPs 和GO 對抗體進行功能化修飾，用于ELISA檢測的雙信號放大，提高了該方法的檢測靈敏度，降低了檢測限，提高了其對痕量樣本的檢測能力，擴大了應用范圍。而且該方法重復性好，操作簡便，具有很強的實用價值。可以預見，改進后的方法將會在蛋白質檢測和診斷學研究中發揮應有的作用。

[1]Engvall E,Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）Quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8:871-874.

[2]van Weemen B K,Schuurs A H W M.Immunoassay using antigen-enzyme conjugates[J].FEBS Lett,1971,15(3):232-236.

[3]張雯迪,蘇萍,楊屹,等..生物素-親和素放大酶聯免疫吸附法測定氯胺酮[J].分析化學,2010,38(1):117-120.

[4]Sai B,Yan Y M,Yang X Y,et al.Gold nanolabels for new enhanced chemiluminescence immunoassay of alpha-fetoprotein based on magnetic beads[J].Chem Eur J,2009,15:4704-4709.

[5]馬文石,周俊文,程順喜.石墨烯的制備與表征[J].高校化學工程學報,2010,24(4):719-722.

[6]Cao W,Chen L,Fu Y J,et al.A highly efficient and versatile microchip capillary electrophoresis method for DNA separation using gold nanoparticle as a tag[J].J Sep Sci,2011,34:939-946.

[7]Cui R J,Liu C,Shen J M,et al.Gold nanoparticle-colloidal carbon nanosphere hybrid material preparation,characterization,and application for an amplified electrochemical immunoassay[J].Adv Funct Mater,2008,18:2197-2204.

[8]Du D,Wang L M,Shao Y Y,et al.Functionalized graphene oxide as a nanocarrier in a multienzyme labeling amplifica-tion strategy for ultrasensitive electrochemical immunoassay of phosphorylated p53(S392)[J].Anal Chem,2011,83(3):746-752.

[9]Wang G F,Huang H,Zhang G,et al.Dual amplification strategy for the fabrication of highly sensitive interleukin-6 amperometric immunosensor based on poly-dopamine[J].Langmuir,2011,27(3):1224-1231.

[10]Silva K P D,Borge J C.The molecular chaperone Hsp70 family members function by a bidirectional heterotrophic allosteric mechanism[J].Protein Peptide Lett,2011,18:132-142.

[11]Zhang L M,Xia J G,Zhao Q H,et al.Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs[J].Small,2010,6(4):537-544.

[12]Shun M,Lu G H,Yu K H,et al.Specific protein detection using thermally reduced graphene oxide sheet decorated with gold nanoparticle-antibody conjugates[J].Adv Mater,2010,22:3521-3526.