LC-MS/MS測定荷瘤裸鼠血漿中和厚樸酚脂質體濃度及其藥代動力學研究

丁士雯 ，馬紅霞，李嫻，劉運龍，陳知航，單成啟，程遠國，陳俐娟

1.吉林農業大學 動物科技學院，吉林 長春 130118；2.軍事醫學科學院 微生物流行病研究所，北京 100071；3.四川大學 生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041

厚樸是中國傳統中藥材，其主要有效成分為厚樸酚、和厚樸酚[1]。現已證明，和厚樸酚具有抑制脂質過氧化[2]、保護脊髓損傷神經[3]、抑制多種細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡[4-6]、逆轉鼻咽癌多藥耐藥性[7]等藥理作用，是一種具有開發潛力的抗癌小分子。但由于和厚樸酚結構中含有酚羥基[8]，易氧化，且水溶性較差，大大限制了其在臨床上的應用。脂質體作為藥物的一種遞送系統，很好地克服了這一缺點，由于脂質體與細胞膜結構相似，使其更容易入胞。腫瘤部位具有增強滲透與滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應的特性，對脂質體表面進行修飾，可使其具有被動或主動靶向性，減少副作用的發生[9-10]。目前，有關和厚樸酚脂質體的藥效學已有報道，其可用于治療淋巴癌，聯合阿霉素抑制4T1細胞的增殖等[11]，但是對其進行藥代動力學的研究報道不多。

我們建立了快速、靈敏、簡便的高效液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）方法，可檢測荷瘤裸鼠血漿中不同時間點和厚樸酚的含量，并對其進行了藥代動力學分析，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

荷瘤裸鼠（16～22 g，由四川大學生物治療國家重點實驗室提供）；和厚樸酚（中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所，純度99.8%，批號：110730-201112）；大黃酚（作為內標）（中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所，純度99.5%，批號：110796-201118）；注射用和厚樸酚脂質體凍干粉（成都金瑞基業生物技術有限公司，批號：2014502，20 mg/瓶）。

API-4000Q Trap 型三重四級桿串聯質譜儀（Applied Biosysytem Sciex 公司）；Agilent1200 高效液相色譜儀（Agilent Technologies 公司）；YMC C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱（YMC 公司）；GL-88B型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-14G 高速離心機（上海醫療器械（集團）有限公司手術器械廠）；比朗超聲波清洗器（上海比朗儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，Fisher Scientific 公司，批號：135525）；甲醇（色譜純，Fisher Scientific 公司，批號：134191）；乙酸乙酯（色譜純，Honeywell International Inc 公司，批號：C0033）；氨水（分析純，北京化工廠，批號：20090616）；純凈水（娃哈哈公司）。

1.2 溶液配制

精密稱取和厚樸酚標準品10.02 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至10 mL容量瓶中，混勻得1 mg/mL的和厚樸酚儲備液，并用甲醇稀釋成系列標準品溶液供分析用。

精密稱取大黃酚標準品10.05 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至10 mL容量瓶中，混勻得1 mg/mL的大黃酚儲備液，備用。

1.3 分析條件

1.3.1 液相條件 YMC C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相B 為0.025%氨水乙腈，A 為0.025%氨水，在線脫氣，流速0.8 mL/min。梯度洗脫：0～2 min，B 相85%～85%；2～4 min，B 相85%～10%；4～6 min，B 相10%～85%；6～8 min，B 相85%～85%，柱溫400C。進樣量10 μL。

1.3.2 質譜條件 離子源電噴霧電離源（ESI），負離子電離模式，霧化氣50 psi，加熱輔助氣50 psi，源溫度為600℃，毛細管電壓-4000 V，掃描方式多級反應監測（MRM），監測離子對m/z 和厚樸酚（265.0→223.0）和內標（253.0→225.0），和厚樸酚和內標碰撞能量分別為-41和-39 V。

1.4 樣品處理

取荷瘤裸鼠血漿樣品45 μL置于1.5 mL Ep管中，加入5 μL甲醇、5 μL內標溶液（1 μg/mL），渦旋混勻，加100 μL 乙腈，渦旋2 min，14 000 r/min 離心10 min，破壞和厚樸酚脂質體，裂解出未游離和厚樸酚。取上清液，進樣測定。

1.5 受試動物給藥方案

荷瘤裸鼠63 只隨機分為9 組，每組雌雄各半。瘤體積約為110 mm3時，尾靜脈注射20 mg/kg 和厚樸酚脂質體，分別于2、5、15 min及0.5、0.75、1、2、4、6 h摘除眼球取血，肝素抗凝，5000 r/min離心5 min分離血漿，分裝后-80℃凍存，備測藥代動力學參數。

2 結果

2.1 質譜分析

采用負離子方式檢測，將和厚樸酚和大黃酚標準品溶液按上述步驟操作，在一級全掃描質譜圖中獲得和厚樸酚和內標分子離子峰，選擇相應準分子離子峰進行碰撞誘導電離，生成碎片離子峰，兩者質譜圖見圖1、2。

2.2 方法學考察

2.2.1 方法專屬性 取濃度為0.500 ng/mL 的和厚樸酚和內標混合標準溶液直接進樣，得和厚樸酚和內標標準品色譜圖（圖3A）；取空白血漿45 μL，除不加內標外，其余按前述樣品處理操作，得空白血漿色譜圖（圖3B）；取0.500 ng/mL 的和厚樸酚血漿樣品，按前述樣品處理操作，得和厚樸酚和內標提取后色譜圖（圖3C）；取荷瘤裸鼠靜脈注射單劑量單次給藥組1 號（給藥后0.75 h 樣品），按前述樣品處理操作，得血漿樣品中和厚樸酚和內標色譜圖（圖3D）。結果顯示，在本實驗條件下，和厚樸酚和內標保留時間分別為2.9和5.1 min，峰形及分離度良好，血漿中雜質不干擾樣品的測定，方法專屬性良好。

2.2.2 線性關系及定量下限 取荷瘤裸鼠空白血漿45 μL，分別加入和厚樸酚系列標準溶液5 μL，配制成血漿中含和厚樸酚質量濃度分別為0.500、2.000、5.000、25.00、100.0、250.0、500.0、1000 ng/mL 的標準曲線樣品，其余加入1 μg/mL 內標溶液同樣品處理方法，進樣測定。以待測物和厚樸酚濃度為橫坐標、待測物與內標峰面積比為縱坐標進行線性回歸，得方程y=0.0147x+0.000711（r2=0.9965）。表明和厚樸酚在0.500～1000 ng/mL 范圍內線性關系良好，定量下限為0.500 ng/mL（S/N＞10）。

2.2.3 回收率 按前述樣品處理方法，制備含和厚樸酚質量濃度分別為1.000、50.00、800.0 ng/mL的含藥血漿，進樣測定，得提取后色譜峰面積At；以水代替空白血漿配成含和厚樸酚1.000、50.00、800.0 ng/mL 的標準溶液，同上處理，得提取后色譜峰面積A0。每個濃度平行4份樣品。以At/A0×100計算得血漿樣品處理方法的絕對回收率，結果見表1。

2.2.4 基質效應 取空白血漿45 μL，除不加內標外，其余按樣品處理方法操作，取上清液，將和厚樸酚標準溶液稀釋成濃度為1.000、50.00、800.0 ng/mL的溶液，進樣測定，記錄峰面積為At；用流動相將和厚樸酚標準溶液稀釋成濃度為1.000、50.00、800.0 ng/mL 的溶液，進樣測定，記錄峰面積為A0。每個濃度平行4 份樣品。以At/A0×100 評價方法基質效應，結果見表1。

表1 LC-MS/MS測定和厚樸酚及內標的絕對回收率和基質效應（n=4，）

表1 LC-MS/MS測定和厚樸酚及內標的絕對回收率和基質效應（n=4，）

圖1 和厚樸酚及內標的一級全掃描質譜圖

圖2 和厚樸酚及內標的產物離子全掃描質譜圖

圖3 測定和厚樸酚特異性色譜圖

2.2.5 稀釋效應 用空白血漿配成1000 ng/mL 的含藥質控樣品，用空白血漿稀釋成濃度為200.0、100.0、50.00 ng/mL 的含藥樣品，每個濃度平行4 份樣品，其余按樣品處理方法操作進樣測定，以測得值與理論值的比值考察稀釋效應。結果顯示，稀釋后其與理論值比值為85.80%～113.86%，無稀釋效應。

2.2.6 精密度與準確度 以空白血漿配制1.000、50.00、800.0 ng/mL 的血漿樣品，按樣品處理方法提取后進樣分析，每個濃度平行測定6份樣品，此為一個分析批。測定3 個分析批，分別用當日標準曲線計算測得濃度。計算批內和批間的相對標準偏差（RSD），評價方法的精密度及準確度，結果見表2。

2.2.7 穩定性實驗 配制1.000、50.00、800.0 ng/mL的含藥血漿，分別進行室溫穩定性、凍融穩定性及長期穩定性實驗，每個樣品平行4份，結果見表3。

2.2.8 藥代動力學研究 測得數據用Microsoft Excel 2007 軟件處理，計算和厚樸酚藥代動力學參數。用Microcal Origin 7.0軟件做平均血藥濃度-時間曲線（圖4）。

表4為荷瘤裸鼠單次靜脈注射和厚樸酚脂質體后和厚樸酚藥代動力學參數。單次靜脈注射和厚樸酚脂質體后，和厚樸酚消除相對半衰期T1/2為49.1±6.1 min，AUC（0～360 min）為173073±49503.3 ng/（min·mL），峰濃度Cmax為12915±4022.5 ng/min，平均滯留時間（MRT）為21.1±3.5 min，表明和厚樸酚脂質體在體內釋放速率較快。

3 討論

研究表明，和厚樸酚能以時間及劑量依賴性方式誘導肺癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤細胞的凋亡，在有效的治療濃度下正常細胞具有良好的耐受性，因而在治療腫瘤方面有良好的開發潛力[12]。脂質體攜帶藥物具有靶向性強、毒副作用小、運載量大等優點，近年來廣泛應用于腫瘤導向治療。Cheng[13-14]等在組織分布及體內小鼠移植瘤模型上均證明修飾的和厚樸酚脂質體明顯優于普通和厚樸酚靜脈制劑。

表2 LC-MS/MS測定和厚樸酚的精密度和準確度（n=6，）

表2 LC-MS/MS測定和厚樸酚的精密度和準確度（n=6，）

對于和厚樸酚的檢測，常用GC 法[15]、HPLCDAD 法[16]、RP-HPLC 法等。本實驗采用LC-MS/MS法，能將質譜的高分辨率、高靈敏度與液相色譜的高分離能力統一起來，提高了靈敏度與檢測限。本實驗中和厚樸酚及大黃酚在色譜柱中得到很好的分離，且在8 min 內運行完畢，分析速度快，具有高準確度、高靈敏度、樣品前處理簡單方便的特點，且對樣品的需求量少，為臨床對和厚樸酚的大樣本量藥代動力學研究提供了方法學參考。

由于和厚樸酚與內標大黃酚結構中酚羥基的存在[17]，其在水溶液中會解離，形成負離子形式，故在檢測時采用負離子模式。在進行流動性的優化過程中，使用乙腈與水進行梯度洗脫時，發現峰形拖尾較為嚴重，由于受試品呈弱酸性，故用甲酸調節酸性對其進行峰形優化，加入不同濃度的甲酸，發現峰形有所改變，但響應值大大減小，甲酸壓低了負離子相應信號。一般液質流動性pH值為pKa+2[18]，受試品pH值在6 左右，因此，向乙腈中加入適量氨水調節pH值，通過對乙腈中氨水含量及水溶液中氨水含量的不斷調整，最終確定0.025%氨水乙腈∶0.025%氨水為流動相。

圖4 荷瘤裸鼠靜脈注射和厚樸酚脂質體后的平均血藥濃度-時間曲線（n=6，）

表3 LC-MS/MS測定和厚樸酚的穩定性（n=4，）

表3 LC-MS/MS測定和厚樸酚的穩定性（n=4，）

表4 6組荷瘤裸鼠尾靜脈注射20 mg/kg和厚樸酚脂質體后主要藥代動力學參數（n=6）

本實驗的方法學驗證滿足了國家食品藥品監督管理總局關于生物樣品分析方法學驗證的要求。荷瘤裸鼠尾靜脈注射20 mg/kg 和厚樸酚脂質體后，血漿中和厚樸酚消除相對半衰期和平均滯留時間較短，表明其在體內釋藥速率較快。血漿中游離和厚樸酚濃度變化還須進一步研究，以期更好地闡明和厚樸酚脂質體的藥代動力學特點。

綜上，通過優化條件，本實驗中樣品采用直接沉淀法，操作簡單，血漿樣品用量僅需45 μL，定量下限為0.500 ng/mL（n=5），分析每個樣品僅需8 min，而且該法具有良好的精密度和準確度，適合和厚樸酚脂質體藥代動力學研究和血藥濃度監測。

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