小花清風(fēng)藤水提物體內(nèi)抗流感病毒的研究

曲新艷，張會(huì)敏，張曉娟，史鵬輝，周喆，王升啟

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

小花清風(fēng)藤（Sabia parvifloraWall，SPS）為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬藤本植物，主要分布于云南、廣西、貴州等地。貴州產(chǎn)小花清風(fēng)藤為布依族、苗族的民間用藥，具有清熱利濕、祛風(fēng)止痛的功效，民間俗稱(chēng)小黃藥、黃腫藥、黃眼藥、雅希強(qiáng)，據(jù)報(bào)道小花清風(fēng)藤在貴州少數(shù)民族地區(qū)常用于治療肝炎，且療效顯著[1]。近年來(lái)，對(duì)小花清風(fēng)藤的現(xiàn)代研究陸續(xù)有報(bào)道，如劉易蓉等發(fā)現(xiàn)小花清風(fēng)藤提取物對(duì)小鼠四氯化碳和撲熱息痛所致肝損傷有保護(hù)作用[2]；楊瑩等發(fā)現(xiàn)小花清風(fēng)藤膠囊對(duì)小鼠四氯化碳和D-半乳糖所致肝損傷有一定的保護(hù)作用[3]。但尚未見(jiàn)有關(guān)小花清風(fēng)藤提取物對(duì)流感病毒作用的研究報(bào)道[4]。本實(shí)驗(yàn)室在篩選抗流感病毒中藥的初步研究中發(fā)現(xiàn)小花清風(fēng)藤具有明顯的抗流感病毒作用，因此，我們以流感病毒感染小鼠為模型，對(duì)小花清風(fēng)藤水提物體內(nèi)抗流感病毒作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 級(jí)BALB/c 小鼠，雄性，體重17～20 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；甲型流感病毒亞型FM1 小鼠肺適應(yīng)株（A/FM/1/47）為本實(shí)驗(yàn)室保存病毒株。

小花清風(fēng)藤水提物（取適量小花清風(fēng)藤藥材，粉碎，第一次用8倍量水煎煮40 min，第二次用6倍量水煎煮40 min，合并2 次水煎煮液，濃縮后4℃保存?zhèn)溆茫涣姿釆W司他韋（購(gòu)自武漢貝爾卡生物醫(yī)藥有限公司）；戊巴比妥鈉（購(gòu)自Sigma 公司）；甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎㄙ?gòu)自北京普利耐特生物科技有限公司）；TRIzol（購(gòu)自Sigma公司）。

1.2 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存時(shí)間的影響

取BALB/c 小鼠60 只，隨機(jī)分成正常組、模型組、磷酸奧司他韋組（i.g，10 mg/kg）、小花清風(fēng)藤水提物低、中、高3個(gè)劑量組（i.g，3.25、6.5、13 g/kg），每組10 只。除正常對(duì)照組外，造模前，將凍存的流感病毒于冰上溶解，用4℃冷藏的PBS（pH7.4）將其稀釋為每20 μL 含4 個(gè)半數(shù)致死量（LD50）的稀釋液。各組小鼠腹腔注射濃度為1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，以4 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只20 μL。感染24 h后灌胃（i.g）給藥，連續(xù)給藥3 d，病毒感染對(duì)照組以等體積生理鹽水灌胃。每日觀察小鼠生存狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d，計(jì)算小鼠生存率和平均存活時(shí)間[5-8]。

1.3 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺指數(shù)的影響

按照1.2 的方法對(duì)小鼠進(jìn)行分組、造模和給藥，于造模后第5 d 對(duì)小鼠禁食8 h。將小鼠稱(chēng)重并摘眼球放血后脫頸椎處死，取出全肺，用生理鹽水洗凈并用濾紙吸干后稱(chēng)量肺重，計(jì)算肺指數(shù)。將左肺浸泡于0.5 mL RNAlater 液中保存于-20℃，右肺固定于0.5 mL福爾馬林中[7-9]。

1.4 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒性肺炎小鼠肺勻漿病毒滴度和肺組織病理改變的影響

稱(chēng)取1.3中RNAlater液浸泡的肺組織50 mg，置于含有0.5 mL TRIzol的EP管（2 mL，無(wú)RNase）中，將EP管置于勻漿機(jī)中研磨（60 Hz，60 s），TRIzol 法提取肺組織總RNA，用甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針?lè)ǎz測(cè)肺勻漿病毒滴度。將1.3 中福爾馬林固定的小鼠右肺做常規(guī)固定、包埋、切片和HE染色后，顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理變化[10-12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠生存率、生存時(shí)間的影響

模型組小鼠生存率為10%，平均存活天數(shù)為8.4 d；小花清風(fēng)藤水提物中劑量組生存率和平均存活天數(shù)明顯升高；磷酸奧司他韋組生存率和平均存活時(shí)間接近于正常組。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響

由圖1A 可見(jiàn)，小花清風(fēng)藤水提物高、低劑量組小鼠的肺指數(shù)低于模型組，但是與模型組比較沒(méi)有顯著性差異，提示小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒引起的小鼠肺部炎癥有一定的抑制作用。

2.3 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織中病毒滴度的影響

由圖1B 可見(jiàn)，與正常組比較，模型組小鼠肺組織中病毒滴度顯著增高，給藥后有所下降，但是與模型組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織病理改變的影響

正常組小鼠肺組織肺泡大小一致，肺泡腔內(nèi)無(wú)分泌物，支氣管上皮完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)肺泡間質(zhì)炎癥；模型組小鼠肺組織大多數(shù)靜脈、支氣管旁出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎細(xì)胞大于5層，肺組織間質(zhì)炎癥病變顯著，呈片狀分布，病變部位大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔顯著增厚，局部肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量滲出物，肺泡腔明顯縮小，局部嚴(yán)重部位肺泡腔消失；磷酸奧司他韋組小鼠肺組織大多數(shù)靜脈、支氣管旁出現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但炎細(xì)胞較模型組少，局部支氣管（及細(xì)支氣管）旁肺組織間質(zhì)散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔輕度增生，間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，炎癥累及范圍較為有限，僅累及個(gè)別支氣管（及細(xì)支氣管）周?chē)伍g質(zhì)組織；小花清風(fēng)藤水提物中劑量組偶見(jiàn)靜脈、支氣管旁袖口裝炎癥浸潤(rùn)，大多數(shù)靜脈、支氣管旁炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，炎細(xì)胞1～5 層，局部支氣管（及細(xì)支氣管）旁肺組織間質(zhì)散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔輕度增生，間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，炎癥累及范圍較為有限，僅累及個(gè)別支氣管（及細(xì)支氣管）周?chē)伍g質(zhì)組織。見(jiàn)圖2。

表1 小花清風(fēng)藤對(duì)流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存時(shí)間的影響（n=10）

圖1 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠肺指數(shù)（A）和肺組織中病毒滴度（B）的影響

圖3 小花清風(fēng)藤水提物對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織病理改變的影響

3 討論

流感是由流感病毒引起的一種急性病毒性呼吸道傳染病，嚴(yán)重危害人類(lèi)生命和健康。流感具有傳染性高、傳播迅速、周期性暴發(fā)和流行的特點(diǎn)。根據(jù)流感病毒核蛋白和基質(zhì)蛋白的抗原性差異，可將流感病毒分為A、B、C 三種類(lèi)型，又將A 型流感病毒按照血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸苷酶（NA）的抗原性差異分成不同的亞型。抗原變異是流感病毒最顯著的生物學(xué)特征，這就使得治療流感病毒的藥物和疫苗很難發(fā)揮最佳治療和預(yù)防效果，所以研究抗流感病毒藥物具有重要意義。目前臨床應(yīng)用的抗流感病毒藥物有金剛烷胺、甲基金剛烷胺、病毒唑等，但這些藥物出現(xiàn)了耐藥性和毒性等問(wèn)題，而中藥在這兩方面具有一定的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展前景[13]。

本研究結(jié)果表明，小花清風(fēng)藤水提物（i.g，6.5 g/kg）能提高小鼠生存率30%，并延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間，降低小鼠肺指數(shù)和肺勻漿中病毒滴度，明顯改善感染小鼠肺組織炎癥病變。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小花清風(fēng)藤水提物在體內(nèi)具有一定的抗流感病毒的作用。

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