單寧酸體外抑制痘苗病毒感染活性的效果分析

劉璇 ，楊益，李瑾慧，孫走南，唐玥，蘇文莉，劉京梅，于雅琴，常國輝

1.吉林大學 公共衛生學院，吉林 長春 130021；2.軍事醫學科學院 疾病預防控制所，北京 100071

植物多酚是一類種類繁多的高分子多元酚化合物，為植物的次級代謝產物，廣泛存在于植物體的葉、果肉及樹皮中，包括藥材、糧食、水果和蔬菜等，并且有很強的生物學活性，能與蛋白質、核酸和金屬離子等相互作用[1-3]。單寧酸（tannic acid）是簡單的水解類植物多酚，其抗腫瘤、抗氧化及抗感染等特性已多有報道[4]。近年來，單寧酸作為廣譜低毒的病毒抑制劑而備受研究者關注[5]。單寧酸的生物學效應可能與其和細胞膜相互作用的能力密切相關[6]。膜熒光各向異性和跨膜電位是細胞膜的重要生物物理學特性，有研究表明，病毒侵入可改變宿主細胞膜的流動性和膜電位[7-8]。因此，我們以痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）WR（Western Reserve）株為研究對象，測定病毒感染對細胞膜流動性和膜電位的影響及單寧酸的干預作用，為揭示單寧酸抑制病毒感染的作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Vero E6 細胞由本實驗室細胞庫保存；VACV WR株由英國布里斯托大學Siddell教授惠贈。

胎牛血清（Sigma，美國）；DMEM、胰蛋白酶（Gibco，美國）；熒光探針DPH（用四氫呋喃配成2.0×10-3mol/L 母液，避光保存于-20℃，臨用前用PBS 稀釋）（Aldrich，美國）；熒光探針DiBAC4（3）（用無水乙醇配成1 mg/mL 母液，避光保存于-20℃，臨用前用PBS 稀釋）（Molecular Probe，美國）；單寧酸（浙江省溫州市甌海精細化工有限公司）；中性紅（國藥集團化學試劑有限公司）；SpectraMax M5 多功能酶標儀（美谷分子儀器公司，美國）；FACSCalibur 流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 實驗分組

實驗分為正常對照組、病毒組、單寧酸組、病毒加單寧酸組（病毒+單寧酸組）。病毒+單寧酸組分為先加入單寧酸后感染病毒（吸附前組）、先感染病毒后加入單寧酸（吸附后組）和感染病毒的同時加入單寧酸（吸附同時組）。

1.3 單寧酸細胞毒性測定

取對數生長期的Vero E6 細胞，按8×104/mL 濃度每孔200 μL接種于96孔板，37℃、5% CO2培養箱中培養，待長成單層細胞后，移去培養液上清，分別加入濃度為1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 的含單寧酸維持液，每孔100 μL；培養24 h 后，采用中性紅比色法，在酶標儀上測定D492nm值，按下式計算細胞存活率，以Probit 回歸方法計算單寧酸半數中毒濃度（TC50）。各組均設4個復孔，實驗重復3次。

細胞存活率（%）=（試驗孔D492nm/對照孔D492nm）×100%

1.4 單寧酸抑制VACV活性測定

制備已長滿單層的96孔細胞培養板，使用單寧酸1～16 μg/mL，分別于病毒吸附前、吸附后及吸附同時干擾病毒感染細胞：①吸附前：單寧酸溶液100 μL/孔孵育1 h，棄液，PBS 洗滌，100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h；②吸附后：100 TCID50病毒液100 μL/孔吸附1 h，棄液，PBS 洗滌，加單寧酸溶液100 μL/孔孵育1 h；③吸附同時：將等體積的100 TCID50病毒液與單寧酸溶液混合后，于細胞培養板加混合液100 μL/孔，37℃孵育1 h。

將上述處理的細胞培養板內液體吸棄，PBS 洗滌后加入維持培養基。設正常細胞對照孔和病毒對照孔，每天于倒置顯微鏡下觀察細胞變化。置37℃、5% CO2培養箱中培養72 h 后，用中性紅比色法檢測。各組均設4個復孔，實驗重復3次。

以Probit 回歸方法計算半數抑制濃度（IC50）；按下式計算病毒抑制率：

病毒抑制率（%）=（藥物處理組D492nm-病毒對照組D492nm）/（細胞對照組D492nm-病毒對照組D492nm）×100%

按下式計算治療指數（TI）：

1.5 熒光偏振法測定細胞膜流動性

在Vero E6 細胞（密度為2×106/mL）中加入100 TCID50的病毒液或16 μg/mL 單寧酸溶液進行孵育。正常對照組加入1 mL細胞維持液，病毒組加入1 mL病毒液，單寧酸組加入1 mL單寧酸溶液，吸附同時組加入1 mL病毒和單寧酸的等體積混合液，以上各組均于37℃孵育1 h。吸附前組先加1 mL 單寧酸溶液，37℃孵育1 h，PBS離洗后再加1 mL病毒液，37℃孵育1 h；吸附后組先加1 mL 病毒液，37℃孵育1 h，PBS洗滌后再加1 mL單寧酸溶液，37℃孵育1 h；孵育時須每15 min搖動混勻一次。

上述各組細胞懸液于1000 r/min離心5 min，棄上清，加入2×10-6μmol/mL DPH 熒光探針溶液1 mL，37℃孵育并不斷振蕩30 min，再用PBS 液洗一次，于激發波長365 nm、發射波長430 nm測定熒光各向異性（r）。r值越大，表示細胞膜流動性越??；反之，流動性越大。

1.6 流式細胞術測定細胞膜電位

細胞處理同1.5，細胞懸液1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入0.1 μg/mL DiBAC4（3）熒光探針溶液1 mL，37℃孵育30 min 后上機測定，用未經熒光物質孵育的Vero E6 細胞調零。熒光增強，表示細胞膜電位絕對值減小，出現去極化變化；反之，熒光減弱，細胞膜電位絕對值增大，出現超極化變化。

1.7 統計學分析

應用SPSS17.0 統計軟件對結果進行分析，實驗數據以x±s表示。組間比較采用方差分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單寧酸對Vero E6細胞的毒性作用

單寧酸對Vero E6細胞的毒性作用表現為細胞增殖緩慢、顆粒較多、折光性強。單寧酸對細胞的毒性作用隨著濃度的降低而逐漸減弱。中性紅比色法測得單寧酸TC50為81.0 μg/mL，TC0為16.0 μg/mL。

2.2 單寧酸抑制VACV感染效果

實驗結果見圖1，單寧酸對病毒的抑制作用隨著濃度的增加而增強。病毒吸附后加入單寧酸，病毒抑制率為18.7%～69.3%（IC50為8.7 μg/mL，TI 為9.3）；病毒吸附同時加入單寧酸，病毒抑制率為11.7%～60.0%（IC50為13.1 μg/mL，TI為6.2）。

2.3 單寧酸對VACV 感染后細胞膜流動性變化的干預作用

VACV感染后宿主細胞膜熒光各向異性顯著低于正常細胞對照組（P＜0.05），說明病毒感染后宿主細胞膜流動性升高。單寧酸處理Vero E6細胞后熒光各向異性與正常對照組接近，說明單寧酸對正常細胞膜流動性無明顯影響。3 種加入方式中，單寧酸在病毒吸附前和病毒吸附后作用，均可使熒光各向異性升高，其中吸附后組與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），說明單寧酸在VACV 吸附后作用可降低宿主細胞膜流動性（表1）。

2.4 單寧酸對VACV 感染后細胞膜電位變化的干預作用

VACV感染Vero E6細胞后，熒光強度顯著低于正常細胞對照組（P＜0.01），說明病毒感染后宿主細胞膜處于超極化狀態。單寧酸作用于Vero E6細胞后，熒光強度顯著低于正常細胞對照組（P＜0.01），說明單寧酸作用同樣使細胞膜處于超極化狀態。單寧酸3種處理方式下，VACV吸附各組的熒光強度值與病毒對照組比較無顯著性差異，說明單寧酸不同處理方式對VACV感染各組中膜電位的變化無明顯干預作用（表2）。

3 討論

單寧酸是相對分子質量為500～3000 的天然酚類化合物，在自然界分布廣泛，因其具有多酚羥基結構而表現出獨特的化學特性和生理活性。VACV是只在靶細胞的胞漿中復制的雙鏈DNA（dsDNA）病毒。成熟的病毒粒子呈橢圓形或磚形，外層有較厚的囊膜包裹，其囊膜含有多種病毒蛋白。病毒感染和復制的過程包括3個步驟：①病毒的吸附、侵入和脫殼；②基因組的轉錄和復制；③病毒的組裝、成熟和釋放。本實驗中，單寧酸以不同加入方式干擾病毒感染細胞，結果顯示，單寧酸以病毒吸附后及病毒吸附同時2種方式加入時，可有效抑制VACV 感染，于吸附前孵育細胞對VACV 侵入細胞無阻斷作用，提示單寧酸抑制VACV感染的機制可能存在于病毒吸附同時和吸附后。

圖1 單寧酸不同加入方式抑制VACV感染效果（，n=3）

病毒的感染首先依賴于病毒吸附蛋白對細胞表面受體的吸附，隨后發生的侵入也同病毒感染成功與否密切相關，這些環節均涉及病毒與細胞膜的相互作用。細胞膜脂質和脂蛋白質都有一定的流動性，細胞膜流動性的改變可影響病毒吸附和侵入細胞[9-10]。如吩噻嗪通過增強細胞膜流動性從而達到抑制丙型肝炎病毒（HCV）與細胞膜融合的效果[11]；而Harada 等發現，在病毒吸附同時和吸附后2 個階段，細胞膜流動性的升高都可以增加人免疫缺陷病毒（HIV）感染率[12]。有研究表明，植物多酚可嵌入細胞脂質雙層膜的表層，影響細胞膜生物學特性[13]。本研究結果顯示，單寧酸對正常細胞膜流動性無明顯影響，而VACV 感染后宿主細胞膜流動性顯著升高。3 種不同加入方式中，只有在感染后加入單寧酸，可以干預病毒感染對細胞膜的影響，細胞膜流動性顯著低于正常對照組。提示單寧酸抑制病毒感染可能存在以下機制：VACV 感染后細胞膜流動性的增加易于單寧酸嵌入脂質雙層膜，致使細胞膜流動性顯著降低，膜流動性的降低干擾了VACV 入胞過程，從而抑制病毒感染。

細胞膜是病毒侵入細胞的第一道重要防線，膜電位是細胞膜重要的生物物理特性。從病毒吸附蛋白與細胞受體特異性結合到內吞入胞，病毒侵入細胞是一個能量依賴的過程。研究表明，脊髓灰質炎病毒和人鼻病毒侵入宿主細胞過程涉及細胞膜電位變化，細胞膜跨膜電位差是促使病毒內化的能態之一[14-15]。本實驗結果表明，VACV 感染Vero E6 細胞后，可使細胞膜發生超極化，形成局部電流，跨膜電位差利于病毒穿入靶細胞內。單寧酸亦使細胞膜處于超極化狀態，并不能有效降低病毒感染引起的細胞超極化現象，說明對病毒借助跨膜電位差進入宿主細胞這一過程無顯著干預作用，由此我們推測單寧酸抑制病毒感染的作用機制可能與此環節無關。

表1 單寧酸對VACV感染后細胞膜流動性變化的干預作用（，n=3）

表1 單寧酸對VACV感染后細胞膜流動性變化的干預作用（，n=3）

與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

表2 單寧酸對VACV感染后細胞膜電位變化的干預作用（，n=3）

表2 單寧酸對VACV感染后細胞膜電位變化的干預作用（，n=3）

與正常對照組比較，aP＜0.01

綜上所述，單寧酸在體外有較強的抑制痘苗病毒感染的作用，其作用機制可能與干預細胞膜流動性有關，具體作用靶點還有待進一步研究。

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