短發夾RNA 載體穩定抑制端粒相關蛋白TERF2IP1 表達的HCT116細胞的構建

廉沈沂，孟麟，楊永勇，壽成超

北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所 生物化學與分子生物學實驗室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142

染色體不穩定和端粒末端結構的異常是導致多種腫瘤發生的重要因素之一，也是多種腫瘤癌前病變的標志事件[1-2]。端粒相關蛋白TERF2IP1（端粒結合蛋白2相互作用蛋白1）是端粒末端Shelterin 復合物成員之一，主要發揮維持基因組穩定，調節端粒長度的功能[3-4]。近年有研究報道提示，TERF2IP1作為保守的核蛋白，不僅可以通過與TRF2 的結合，在端粒末端發揮抑制同源重組修復和非同源重組修復的作用，還可以通過與胞漿蛋白的結合轉位至細胞漿中，參與NF-κB信號通路的活化[5]。同時，TERF2IP1蛋白也可作為轉錄因子，通過與染色質的非端粒位點的結合，參與下游多種信號通路的調控[5-8]。為避免短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的脫靶效應，提高獲得穩定干擾細胞系的成功率，我們設計并合成了分別針對TERF2IP1基因不同位點的4 對寡核苷酸序列，克隆至pGP-H1/Hygro 載體，瞬時轉染結腸癌細胞系，通過抗性篩選，獲得穩定低表達TERF2IP1基因的結腸癌HCT116 細胞系，為后續研究TERF2IP1 蛋白在結腸癌發生發展中的作用提供了技術平臺，對研究TERF2IP1在腫瘤進展中的功能具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

結腸癌細胞系HCT116及載體pGP-H1/Hygro均由北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所實驗室保存。

1.2 重組質粒的構建

將合成的TERF2IP1shRNA正義和反義寡核苷酸序列退火形成雙鏈DNA，與經BamHⅠ/HindⅢ雙酶切的pGP-H1/Hygro 載體混合，用T4DNA 連接酶4℃連接過夜，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取單克隆菌種進行擴增，并大量提取質粒，質粒送北京華大基因公司測序。

1.3 純陽性干擾細胞的篩選

轉染前一日將HCT116 細胞按5×106/孔鋪到6孔板。用LipofectAMINE 2000 轉染質粒：稀釋要轉染的質粒4 μg 到400 μL 無血清培養基中，同時稀釋LipofectAMINE 2000 10 mL到400 mL無血清培養液中，5 min內將質粒和轉染液輕輕混合均勻，室溫放置30 min；棄去培養液，用無血清DMEM 培養液漂洗細胞2次，加上述混合物至六孔板細胞中，繼續培養4～6 h，換完全培養基培養；2 d后用400 μg/mL 的潮霉素篩選抗性克隆，每隔2～3 d 換液（含400 mg/mL潮霉素）；12～15 d后細胞克隆開始形成，并有一定的細胞數量，用無菌小濾紙片蘸取消化液，將細胞克隆消化后轉移到24孔板中繼續培養，在這一過程中，注意不要使各個克隆之間有相互污染；24孔板長滿后，消化轉移至6 孔板中繼續培養；6 孔板培養4～6 d，將各個細胞克隆消化，其中1/3 部分繼續培養，剩余2/3 部分進行后續檢測；將檢測為陽性的克隆轉到10 cm皿中繼續培養，同時凍存保種。

1.4 實時熒光定量RT-PCR 檢測TERF2IP1 mRNA的表達

為檢測shRNA 干擾HCT116 細胞后TERF2IP1mRNA 的表達情況，按TRIzol 說明書提取HCT116-control-shRNA 組 和HCT116-TERF2IP1-shRNA 組細胞的總RNA，反轉成cDNA，取1 μL cDNA 進行PCR擴增。將1 OD的Real-Time PCR上、下游引物分別用TE配成1 mg/mL的儲液，37℃溶解，上、下游引物各取1 μL混勻稀釋至10 μL，取1 μL進行Real-Time PCR 反應（94℃初始變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40 次），最后用2-ΔΔCT對結果進行分析。

1.5 Western印跡檢測TERF2IP1的表達

用本實驗室自制的細胞裂解緩沖液［50 mmol/L Tris-Cl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS］，新鮮加入蛋白酶抑制劑及DTT，裂解干擾的細胞，4℃、12 000 r/min 離心15 min，收取裂解上清作為樣品，用BCA 法測定樣品蛋白濃度，取等量上清液進行SDS-PAGE，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST液于室溫封閉1.5 h，加入TERF2IP1鼠單抗（1∶1000稀釋），GAPDH作為內參，4℃反應過夜，PBST洗膜3次，5 min/次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗（1∶2000）室溫反應45 min，PBST 洗膜3 次，5 min/次，暗室內用ECL 發光法顯色5 min，檢測目的條帶，壓片顯影定影，以GAPDH作為內參分析結果。

2 結果

2.1 TERF2IP1 shRNA序列的設計

根據文獻報道的TERF2IP1基因小干擾RNA（siRNA）序列，按照shRNA 表達載體的構建原則重新設計TERF2IP1shRNA基因的正義和反義寡核苷酸序列。為提高干擾效率，共設計4對TERF2IP1基因的shRNA序列。TERF2IP1shRNA和對照shRNA序列由北京賽百盛公司合成（表1）。

2.2 重組shRNA質粒載體的測序鑒定

測序結果顯示，對照shRNA 和4 條TERF2IP1shRNA 序列均已正確插入pGP-H1/Hygro 載體（圖1）。

2.3 shRNA 干擾HCT116 細胞后TERF2IP1 基因的表達

表1 構建用oligo DNA序列

圖1 shRNA質粒載體的測序結果

提取轉染空載體組和轉染干擾序列組的HCT116 細胞總RNA，采用實時熒光定量PCR 檢測各組細胞的TERF2IP1相對表達量。結果見圖2，轉染對照組和轉染干擾序列組中可見TERF2IP1基因的陽性表達，TERF2IP1干擾質粒轉染組中其表達量明顯降低，TERF2IP1基因的表達抑制率分別為43%、27%、17%和53%。

2.4 HCT116 細胞的干擾和Western 印跡分析TERF2IP1蛋白的抑制效果

對實時熒光定量PCR檢測為有效干擾的單克隆進行擴大培養，提取細胞總蛋白行Western 印跡檢測，結果如圖3。與轉染對照相比，轉染TERF2IP1-shRNA-1321 的細胞中TERF2IP1 蛋白的表達抑制率最高為48.6%，轉染TERF2IP1-shRNA-1037 和TERF2IP1-shRNA-1112后TERF2IP1蛋白的表達抑制率分別為63.1%和73.8%。實驗結果表明穩定干擾TERF2IP1基因的HCT116細胞系構建成功。

圖2 實時熒光定量PCR檢測shRNA對HCT116細胞中TERF2IP1 mRNA表達的影響

3 討論

圖3 Western印跡檢測shRNA對HCT116細胞中TERF2IP1蛋白表達的影響

迄今為止，關于TERF2IP1的功能和機制研究均證實TERF2IP1在維持端粒穩定、抑制基因組不穩定中發揮重要作用，同時在端粒外發揮基因調控的功能。近年研究表明，在乳腺癌細胞中敲低TERF2IP1基因的表達，可以抑制乳腺癌細胞的遷移侵襲[5]。實驗證實TERF2IP1 與TERF2 協同與非端粒位點的DNA 結合，參與多通路基因的轉錄調控，包括細胞骨架調節蛋白、鈣離子通道調節蛋白及DNA損傷修復通路[6]。因此，我們可以推測TERF2IP1基因參與人類生理和病理狀態下多個過程，探索TERF2IP1在不同疾病尤其是腫瘤中的功能將會成為研究熱點。

RNA 干擾（RNAi）技術是通過雙鏈RNA 介導同源靶mRNA 的特異性降解，導致轉錄后基因的表達沉默，是一種高效、特異的基因調節技術，最初在1998 年的秀麗新小桿線蟲研究中被發現[9-10]。在RNAi技術實際應用中，shRNA/siRNA的適宜作用濃度、最佳作用時間及轉染試劑都是影響基因沉默的關鍵因素，所以實驗的穩定性和一致性較難控制。將shRNA靶序列克隆至含H1/U6啟動子和真核抗性篩選標簽的載體中，進行瞬時轉染后的細胞抗性篩選，為獲得穩定的特定基因沉默的細胞系提供了有力的實驗手段。

HCT116細胞具有在裸鼠體內成瘤的能力，因此是研究結腸癌發生發展和轉移的有力工具。腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，癌基因的激活是腫瘤發生的始動因素之一，癌基因激活后，除可導致細胞增殖和侵襲能力增強等生物表型外，也可導致染色體結構不穩定進而引起DNA 雙鏈斷裂等分子表型。因此，研究和探索腫瘤發生和轉移過程中的染色體和端粒相關分子事件，一直是研究人員持續關注的熱點問題[11-12]。為了更好地探討TERF2IP1在結腸癌中的功能和作用，我們根據短發夾RNA 的設計原則和要點，設計合成了4 對shRNA寡核苷酸序列，克隆至pGP-H1/Hygro 載體中，瞬時轉染HCT116 細胞后，利用潮霉素進行細胞抗性的篩選，獲得穩定干擾TERF2IP1基因表達的結腸癌細胞系。實時熒光定量PCR 和Western 印跡檢測結果均提示經潮霉素篩選后穩定干擾了HCT116 細胞中TERF2IP1基因的表達。該細胞模型的建立，為深入研究TERF2IP1基因的功能提供了有效的生物學工具，也為研究TERF2IP1基因與腫瘤的關系提供了技術支持。

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