抗FKBP52人源單鏈抗體的篩選及其完整抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建

丁立，熊麗娟，王欲曉，吳成林，付凱飛，周麗君

1.南方醫(yī)科大學(xué) 第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630；2.海軍總醫(yī)院 中心實驗科，北京 100048

FK506結(jié)合蛋白52（FK506 binding protein 52，F(xiàn)KBP52）屬于免疫抑制劑FK506 結(jié)合蛋白（FKBP）家族，主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，也有一部分存在于胞質(zhì)中。FKBP52由459個氨基酸殘基組成，其編碼基因FKBP4定位于染色體12p13.33，全長10 482 bp。已知FKBP52 在調(diào)控甾體激素受體信號通路及中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元微管功能中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)FKBP52 與多種癌癥、生殖與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如在前列腺癌（雄激素相關(guān)）病人前列腺穿刺活檢中可檢測到高表達(dá)的FKBP52，在反復(fù)自然流產(chǎn)病人（孕激素相關(guān)）中FKBP52蛋白表達(dá)水平則顯著降低；基因敲除實驗還發(fā)現(xiàn)FKBP52可與病理性Tau蛋白相互作用介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)退行性變[2]。值得一提的是，F(xiàn)KBP52 的小分子配體已被認(rèn)為是潛在的營養(yǎng)神經(jīng)藥物[3]。以上均提示FKBP52或可成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物及潛在治療靶點[4]。因此，我們擬運用噬菌體抗體庫技術(shù)，通過自行構(gòu)建的大容量噬菌體抗體庫，以FKBP52為抗原，篩選特異性人源抗FKBP52單戀抗體（scFv），并進(jìn)一步通過同源重組技術(shù)構(gòu)建完整抗體的真核表達(dá)載體，為實現(xiàn)抗FKBP52人源抗體的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌XL-1Blue、HB2151 菌株，輔助病毒VCSM13 由本實驗室保存；大容量噬菌體抗體庫及含有輕、重鏈恒定區(qū)的pCMV-L 和pCMV-H 抗體真核表達(dá)載體由本實驗室構(gòu)建；FKBP52 蛋白、親環(huán)素A 由美國科羅拉多州丹佛大學(xué)卡爾·K·愛德華教授惠贈；卵清蛋白（OA）和鐵蛋白（Fer）購自Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的抗M13 小鼠單抗購自GE 公司；HRP標(biāo)記的抗V5 小鼠單抗購自Invitrogen 公司；同源重組試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自promega 公司；免疫管（Immunotube）購自NUNC公司；ELISA板購自CORING公司。

1.2 大容量噬菌體抗體工作庫的制備及抗FKBP52噬菌體抗體的篩選

篩選所用大容量噬菌體抗體工作庫由本實驗室保存的原始抗體庫制備，具體實驗方法見文獻(xiàn)[5]。抗FKBP52 人源抗體的篩選采用酸洗脫方法[6]，實驗步驟主要包括：將FKBP52 蛋白用包被液（0.1 mol/L NaHCO335 mL，0.1 mol/L Na2CO315 mL，H2O 50 mL）稀釋至50 μg/mL，包被免疫管，4℃過夜后用5%的脫脂奶粉37℃封閉3 h，加入1 mL 制備好的噬菌體抗體庫，37℃孵育3 h，用含1‰ Tween 的PBS 洗15 次，加入1 mL 甘氨酸鹽酸（pH2.2）洗脫（37℃10 min），Tris 堿中和后加入1 mL XL-1Blue，37℃、15 min，轉(zhuǎn)入錐形瓶并取10 μL鋪含氨芐西林（Amp）的培養(yǎng)盤測定菌落形成單位（CFU），錐形瓶于37℃搖床培養(yǎng)約1 h 后補(bǔ)足含Amp 的SB 培養(yǎng)基至100 mL，37℃、200 r/min 培養(yǎng)5 h 后加入VCSM13，30℃培養(yǎng)過夜，次日離心收集上清，PEG、NaCl 沉淀后得級次噬菌體抗體庫，加入免疫管進(jìn)行第2輪篩選，如是篩選4 輪。計算每輪獲得的噬菌體抗體庫的滴度，通過計算每輪抗體庫投入和產(chǎn)出比（富集率），評價抗FKBP52噬菌體抗體的篩選是否有富集。

1.3 噬菌體抗體的篩選及特異性鑒定

分別從第3、4輪篩選的含Amp的培養(yǎng)盤中隨機(jī)挑取單克隆，置于含Amp 的LB 培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期后加入VCSM13 誘導(dǎo)感染，30℃培養(yǎng)過夜后離心取上清即得到噬菌體抗體。

噬菌體抗體特異性鑒定采用ELISA 方法：稀釋FKBP52 抗原至5 μg/mL，50 μl/孔包被ELISA 板，4℃過夜，用5%脫脂奶粉于37℃封閉3 h后加入噬菌體抗體，37℃孵育2 h，用含1‰ Tween 的PBS 洗后加入二抗（HRP 抗M13 小鼠單抗），37℃孵育2 h，洗滌后加入TMB底物顯色液顯色，用酶標(biāo)儀讀取D450nm值，根據(jù)讀數(shù)選出陽性克隆，再以O(shè)A、Fer 為抗原包被ELISA板，以測定噬菌體抗體的特異性。

1.4 噬菌體抗體可變區(qū)基因DNA序列測定

挑選出經(jīng)上述步驟篩選到的特異性陽性克隆送諾賽公司測序，運用相關(guān)軟件對獲得的陽性克隆進(jìn)行序列分析。

1.5 抗FKBP52-scFv的可溶性表達(dá)及檢測

將序列分析后基因型不同的噬菌體抗體按照文獻(xiàn)[7]所述步驟感染新鮮培養(yǎng)的HB2151 菌后，挑選單克隆于37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（1 mmol/L）于30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜后離心收取上清，獲得可溶性FKBP52-scFv。采用ELISA 方法對對可溶性抗體進(jìn)行特異性檢測，無關(guān)抗原除OA、Fer 外增加親環(huán)素A。實驗中一抗為可溶性上清，二抗為HRP 抗V5小鼠單抗（針對載體上含有的14個氨基酸殘基的V5標(biāo)簽：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr），其余步驟同噬菌體抗體特異性測定。

1.6 抗體的親和力測定

抗體-抗原親和力檢測采用生物膜干涉（biolayer interferometry，BLI）法[8]，由北京拓普百奧科技公司用ForteBio公司的RED96型生物分子相互作用儀進(jìn)行測定，所得結(jié)合動力學(xué)曲線采用FortebBio 數(shù)據(jù)分析軟件以1∶1 模型擬合獲取結(jié)合常數(shù)（Kon）、解離常數(shù)（Kd）和親和常數(shù)（KD）。

1.7 完整抗體輕、重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.7.1 完整輕、重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建 采用同源重組的方法[9]。根據(jù)篩選獲得的scFv 輕、重鏈可變區(qū)設(shè)計相應(yīng)上、下游引物，PCR 分別擴(kuò)增輕、重鏈可變區(qū)基因，用同源重組試劑盒分別與輕、重鏈真核表達(dá)載體pCMV-L 和pCMV-H 進(jìn)行同源重組，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，鋪卡那霉素（Kan）抗性盤，37℃孵育過夜，獲得完整抗體真核表達(dá)載體。

1.7.2 完整輕、重鏈真核表達(dá)載體的陽性克隆的鑒定 采用常規(guī)菌液PCR 方法，隨機(jī)挑選Kan 盤上單克隆菌為模板，擴(kuò)增可變區(qū)及完整抗體片段，選擇經(jīng)PCR方法鑒定為陽性的克隆送諾賽公司測序。

2 結(jié)果

2.1 實際工作庫的制備

用原始庫超感染BS1365 菌后得到的次級庫滴度為1.26×1013，再用其感染對數(shù)期XL-1Blue菌后得到的工作庫滴度為5.0×1014，用于下步抗體篩選。

2.2 抗FKBP52噬菌體抗體的篩選及鑒定

經(jīng)4輪篩選，抗FKBP52噬菌體抗體的回收率達(dá)千倍富集（表1），分別從3、4輪隨機(jī)挑選500個克隆制備噬菌體抗體，ELISA結(jié)果表明其中126個克隆可與FKBP52 結(jié)合，進(jìn)一步的特異性測定表明其中45個克隆與OA、Fer蛋白等無關(guān)抗原不結(jié)合，其特異性克隆占35%。

2.3 噬菌體抗體可變區(qū)基因DNA 序列分析及可溶性表達(dá)

對獲得的特異性克隆測序后對可變區(qū)DNA 進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)46個陽性克隆具有15種不同基因型。將15種陽性噬菌體抗體上清感染HB2151菌獲得可溶性表達(dá)，進(jìn)一步進(jìn)行特異性測定，其中7種獲得可溶性表達(dá)（圖1）。對這7 種單鏈抗體可變區(qū)進(jìn)行分析，其輕鏈可變區(qū)分屬VκⅠ、VκⅢ、VλⅠ亞群，而重鏈可變區(qū)則分屬VHⅠ、VHⅢ、VHⅣ亞群。

2.4 噬菌抗體的親和力測定

從7種可溶性表達(dá)活性較高的陽性克隆中挑選4種進(jìn)行親和力測定，結(jié)果見表2。

2.5 完整輕重鏈真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

選擇親和力較好的克隆3，用同源重組方法分別構(gòu)建輕、重鏈真核表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化，各挑取10個克隆PCR鑒定，其中輕、重鏈陽性克隆分別為9和10個，陽性率分別為90%和100%；進(jìn)一步挑選2 個陽性克隆進(jìn)行DNA測序，結(jié)果顯示全部正確，圖2為其中一個陽性克隆的PCR鑒定結(jié)果。說明已構(gòu)建成表達(dá)完整輕、重鏈的真核表達(dá)載體。

表1 抗FKBP52噬菌體抗體篩選各輪回收率

圖1 可溶性抗體的特異性檢測

3 討論

FKBP52 因其特征性的對甾體激素受體及中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元微管的調(diào)控功能而被證實與多種疾病存在關(guān)聯(lián)。最新研究發(fā)現(xiàn)，其在前列腺癌、乳腺癌、肝癌中均有著顯著的高表達(dá)[10-11]，而在反復(fù)自然流產(chǎn)（RSA）、先兆子癇（PE）及胎兒宮內(nèi)生長受限（IUGR）等生殖疾病中亦有著明顯異常的表達(dá)[12-13]。另外，其還在一定程度上介導(dǎo)Tau蛋白病的發(fā)生，且被認(rèn)為參與了花青素潛在預(yù)防阿爾茲海默病（AD）的作用機(jī)制[14]。種種研究均表明FKBP52 可作為前列腺癌、乳腺癌、肝癌的早期診斷標(biāo)志，且有望成為上述癌癥及生殖相關(guān)疾病的治療靶點。此外，對FKBP52 表達(dá)水平早期測定有助于預(yù)測AD 的發(fā)生，而針對提高FKBP52 活性的藥物還可能成為預(yù)防及治療AD的有效手段[15]。故研制針對FKBP52的人源化抗體有著非常實際的應(yīng)用價值及發(fā)展前景，同時也有助于更好地深入評價其功能。

噬菌體抗體庫技術(shù)是起源于上世紀(jì)90 年代的一種人源抗體制備技術(shù)，因其操作簡便、快速等特點，在早期針對新型治療靶點人源抗體的制備及評價方面有良好的應(yīng)用前景。為進(jìn)一步探討FKBP52作為自身免疫性疾病治療靶點的潛質(zhì)，我們使用本室自行構(gòu)建的大容量噬菌體scFv抗體庫，通過吸附、擴(kuò)增、洗脫過程篩選抗FKBP52 的噬菌體抗體，經(jīng)ELISA測定、DNA序列分析，獲得了多株具有不同基因型的抗FKBP52 人源scFv。基于以往研究經(jīng)驗，為了避免噬菌體抗體基因Ⅲ蛋白對scFv結(jié)構(gòu)的影響造成的假陽性，我們進(jìn)一步對獲得的噬菌體抗體進(jìn)行了可溶性表達(dá)，最終獲得了7 株基因型不同的特異性抗體。同時，我們挑選特異性結(jié)合活性高的4株進(jìn)行了親和力測定，結(jié)果顯示親和力均在10-8范圍內(nèi)，尚未達(dá)到可用的10-9，符合噬菌體抗體篩選的普遍特性，可能與scFv同抗原結(jié)合單價相關(guān)，有待表達(dá)完整抗體后再進(jìn)行親和力測定，相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

表2 不同克隆的親和力測定

圖2 完整抗體輕、重鏈表達(dá)載體的PCR測定

噬菌體抗體技術(shù)作為一種成熟的工程抗體制備技術(shù)，已被廣泛用于特異性抗體片段的制備中，但由于制備的僅是抗體功能片段，半衰期短，加上多為原核表達(dá)載體，抗體片段蛋白沒有經(jīng)過蛋白翻譯后修飾，很難滿足治療性抗體需要，因此必須將篩選獲得的抗體片段轉(zhuǎn)換為真核表達(dá)的完整抗體分子。以往進(jìn)行真核表達(dá)載體構(gòu)建時多采用酶切的方法，但往往耗時長、連接效率不高。在本研究中，我們選擇親和力較好的一株scFv，采用同源重組方法進(jìn)行了完整抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建，并通過了PCR 驗證及測序確證。重組方法操作簡便、快速且成功率高，為將抗體庫篩選獲得的小分子抗體轉(zhuǎn)換為完整抗體提供了新方法。目前我們已在HEK293-F細(xì)胞中表達(dá)了完整抗FKBP52 人源抗體，正在對獲得的抗體進(jìn)行分離純化及功能測定，結(jié)果將后續(xù)報道。

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