人自噬相關(guān)基因12真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

紀(jì)貝貝 ，張鵬，徐小潔，梁迎春，黃蓉，范忠義，李玲，郭靖，洪甜，，葉棋濃，杜楠

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫(yī)院 第一附屬醫(yī)院，北京 100048；3.解放軍302醫(yī)院 普外診療中心，北京 100039

人自噬相關(guān)基因12（autophagy related gene 12，ATG12）是自噬相關(guān)基因家族成員，對自噬的形成至關(guān)重要[1]。自噬是細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)多數(shù)衰老長半衰期蛋白質(zhì)可通過自噬途徑降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定[2]。研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腫瘤、病原體免疫的過程，自噬可通過一系列機(jī)制將腫瘤細(xì)胞[3]、入侵的病原體[4]等降解，其機(jī)制為，來自高爾基復(fù)合體或粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的單層或雙層膜將抗原包裹后形成自噬泡，自噬泡的外膜與溶酶體膜融合，內(nèi)膜及其包裹的物質(zhì)進(jìn)入溶酶體腔，被溶酶體中的酶水解，從而維持機(jī)體穩(wěn)定。

ATG12 可以和ATG5、ATG16 結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物參與自噬體的形成[5]，在自噬過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。ATG3 蛋白是一種泛素樣綴合酶，它和ATG10 是促進(jìn)ATG8 和ATG12 泛素樣蛋白結(jié)合的2種E2 樣酶[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道稱，在自噬過程中ATG12可與ATG3 相互作用[9]。鑒于ATG12 在自噬中的重要作用，我們擬構(gòu)建ATG12 的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證表達(dá)的myc-ATG12 融合蛋白與ATG3 的相互作用，為進(jìn)一步研究ATG12與自噬的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細(xì)胞由本室傳代培養(yǎng)；pXJ-40-myc載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；Flag-ATG3 質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建；VigoFect 為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PCR 試劑均購自TaKaRa 公司；上、下游引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；質(zhì)粒提取、膠回收、PCR 回收試劑盒購自Promega公司；HRP標(biāo)記的抗myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體（myc-HRP）和抗Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體（Flag-HRP）購自Sigma公司；DMEM及小牛血清購自Gibco公司；測序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 myc-ATG12重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測序

以本實(shí)驗(yàn)室保存的人乳腺文庫為模板，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]的ATG12 編碼序列合成上游引物（5'-CG GGATCCATGGCGGAGGAGCCGCAGTCTG-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGTCATCCCCACGCCTGAG ACTTGC-3'），PCR 擴(kuò)增人ATG12 的編碼序列（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/XhoⅠ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA 連接酶連接入pXJ-40-myc載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測

按常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用不含雙抗、含100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%為宜，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h 換液。將4 μL VigoFect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒與200 μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空pXJ-40-myc 載體作為對照，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h換液。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞蛋白，加入2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進(jìn)行SDSPAGE后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗myc 標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫共沉淀檢測ATG12和ATG3的相互作用

將人胚腎293T 細(xì)胞接種于6 cm 皿中，用重組myc-ATG12 與Flag-ATG3 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4～6 h 換液，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，加入中鹽（0.25 mol/L）IP 緩沖液后與myc-beads 于4℃結(jié)合4～6 h，3000 r/min 離心5 min，經(jīng)中鹽IP 緩沖液再次漂洗后，加入與myc-beads 等量的2×SDS 加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標(biāo)記的抗myc和Flag標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色，5 min后壓片顯影。

2 結(jié)果

2.1 myc-ATG12重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以實(shí)驗(yàn)室保存的人乳腺文庫為模板，PCR 擴(kuò)增人ATG12 的編碼序列，獲得約420 bp 的DNA 片段，與預(yù)期一致（圖1）。將PCR 產(chǎn)物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的pXJ-40-myc 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和420 bp的條帶，而相應(yīng)的空載體酶切只見大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖2）。測序結(jié)果表明，插入片段的DNA 序列與人ATG12基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

圖1 PCR擴(kuò)增人ATG12的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒myc-ATG12的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

2.2 Western 印跡檢測myc-ATG12 在293T 細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的myc-ATG12 重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western 印跡檢測myc-ATG12 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP 抗體能夠在相對分子質(zhì)量約17×103處檢測到明顯的特異性條帶，而空載體則無條帶（圖3）。說明myc-ATG12重組蛋白在293T細(xì)胞中能夠正確表達(dá)。

2.3 免疫共沉淀檢測ATG12與ATG3的相互作用

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ATG12 可與ATG3 蛋白相互作用。為進(jìn)一步證實(shí)構(gòu)建的myc-ATG12 重組質(zhì)粒正確，且能夠表達(dá)正確的融合蛋白，將重組myc-ATG12 質(zhì)粒與Flag-ATG3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，24 h常規(guī)培養(yǎng)后收集蛋白，免疫共沉淀分析觀察顯示，myc-ATG12 融合蛋白與Flag-ATG3 蛋白具有相互作用，而myc 空載體在同一位置無此條帶，表明ATG12 與ATG3 蛋白能夠在體內(nèi)特異地相互作用，而myc 標(biāo)簽不影響ATG12 的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能（圖4）。進(jìn)一步證明構(gòu)建的重組myc-ATG12質(zhì)粒正確，且能夠正常表達(dá)。

3 討論

自噬是一種普遍而又重要的生命現(xiàn)象，廣泛參與多種生理和病理過程，特別是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。目前，自噬的調(diào)控作用被廣泛關(guān)注并加以研究，以求從分子水平上對腫瘤進(jìn)行治療，從而達(dá)到根治的目的[11-13]。針對ATG的調(diào)控是現(xiàn)在自噬研究的熱點(diǎn)。根據(jù)其在自噬過程的不同階段發(fā)揮作用的不同，可將ATG 分為以下三類：一是ATG1-ATG11-ATG17-ATG20-ATG24-ATG29-ATG31 和ATG13-ATG8 復(fù)合體，二是ATG6-ATG14-Vps34-Vps15 復(fù)合體，三是ATG12-ATG5-ATG16和LC3-II-PE泛素樣蛋白系統(tǒng)[14]?？梢夾TG12與自噬體的形成密切相關(guān)。有研究顯示ATGl2缺失的小鼠胚胎干細(xì)胞前自噬體結(jié)構(gòu)和自噬體的數(shù)量明顯減少[15]。

圖3 Western印跡檢測myc-ATG12的表達(dá)

圖4 免疫共沉淀分析驗(yàn)證重組ATG12與ATG3在蛋白水平上具有相互作用

ATG12 定位于細(xì)胞質(zhì)和自噬體中，同時(shí)介導(dǎo)自噬和凋亡兩條通路[16]，在自噬過程中和ATG5的結(jié)合是不可逆的，同時(shí)與ATG3 的結(jié)合區(qū)域也有很多疑惑待解決[17]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的myc-ATG12在真核細(xì)胞中獲得了表達(dá)，且表達(dá)的融合蛋白能夠與ATG3 蛋白相互作用。ATG12 在真核細(xì)胞中的成功表達(dá)，是繼續(xù)深入研究其在自噬中的作用機(jī)制，以及探討其利用價(jià)值的基礎(chǔ)。

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