小分子化合物Me6TREN促進小鼠骨髓中造血干/祖細胞的增殖

楊舒 ，張靜，王思涵，范增，王靜雪，韓毅，田宇，何麗娟，陳琳，岳文，李艷華，裴雪濤

1.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021；2.軍事醫學科學院 野戰輸血研究所干細胞與再生醫學研究室，北京 100850；3.軍事醫學科學院 華南干細胞與再生醫學研究中心，廣東 廣州 510005

造血干/祖細胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）是一群具有長期自我更新及定向分化成各系血細胞能力的細胞[1]。臨床上，常采用造血干/祖細胞移植重建骨髓損傷患者的造血系統及免疫系統[2]。長期以來，造血干/祖細胞移植被用于治療多種疾病，例如白血病等惡性血液病、重型再生障礙性貧血、自身免疫性疾病、急性放射病等[3]。

移植的造血干/祖細胞能否成功重建受者的造血及免疫系統取決于多方面的因素，如移植的造血干/祖細胞的數量、造血干/祖細胞的歸巢效率、免疫排斥反應等[3-4]。目前，臨床上主要采集外周血中的造血干/祖細胞作為移植細胞來源。在正常情況下，外周血中的造血干/祖細胞數量有限，為獲得足夠數量的造血干細胞，需要使用動員劑如粒細胞集落刺激因子（G-CSF）將骨髓中的造血干/祖細胞動員至外周血循環中[5]。我們新發現的小分子化合物Me6TREN（以下簡稱Me6）也具有將骨髓造血干/祖細胞動員至外周血的能力，有望成為一類新型的造血干/祖細胞動員劑候選藥物[6]。近年來，臍帶血造血干細胞移植在臨床上的應用逐年增多[7-8]。但臍帶血中的造血干/祖細胞數量較少，一份臍帶血不能滿足成年病人的治療細胞量，因此需要對其進行擴增來獲得足夠數量的造血干/祖細胞[9]，目前已有研究團隊開展體外擴增的造血干/祖細胞移植病人的臨床試驗[10]。優化造血干細胞擴增的培養體系，有助于進一步推動臍帶血來源的造血干/祖細胞的臨床應用。

Me6 是一類飽和胺類化合物，屬于一類新型醫藥中間體，可用于制備遠螯聚合物的原子轉移自由基聚合（ATRP）配體。我們在前期工作中發現，單次皮下注射Me6 能將小鼠骨髓中的造血干/祖細胞快速有效地動員至外周血中[6]。傳統的造血干/祖細胞動員劑G-CSF在動員造血干/祖細胞的同時，能促進造血干/祖細胞的擴增[11]，而化合物Me6 是否也能夠促進造血干/祖細胞的擴增尚不明了。為此，我們檢測了皮下注射Me6 的小鼠骨髓內造血干/祖細胞數量及比例的變化，并利用體外培養體系進一步考察了該化合物是否影響造血干/祖細胞的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性C57BL/6 小鼠，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證：SCXK-（京）2012-0001；飼養于軍事醫學科學院SPF級實驗動物房。將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組（Con組）和Me6組。檢測前12 h，對Me6組C57BL/6小鼠皮下注射Me6，劑量為5 mg/kg；對照組注射PBS。

Me6TREN 購自Sigma 公司；紅細胞裂解液購自BD公司；小鼠淋巴細胞分離液購自灝洋生物制品科技有限責任公司；流式抗體Lineage APC-Cy7（CD3，CD11b，Ter-119，B220，Ly-6G）、Sca-1 PE-Cy7、c-Kit Alexa Fluor 700 均購自eBioscience 公司；α-MEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；干細胞生長因子（SCF）、重組人血小板生成素（TPO）、白細胞介素3（IL-3）、白細胞介素6（IL-6）均購自Peprotech公司；半固體集落培養基M3434購自StemCell公司。

1.2 小鼠骨髓單個核細胞的分離培養

用頸椎脫臼法處死小鼠后，置于75%酒精中消毒，在無菌環境下分離小鼠股骨，用1 mL 注射器吸取培養液，將骨髓細胞沖出至離心管中，2000 r/min離心5 min，得到細胞沉淀，用5 mL PBS重懸細胞，加到等體積的淋巴細胞分離液上層，2000 r/min 離心20 min（離心機調至慢升慢降），收集中間層細胞，用PBS洗滌2次，得到單個核細胞。將細胞種于含有500 μL 培養基（α-MEM 培養基中加入10%胎牛血清，SCF 50 ng/mL，TPO 10 ng/mL，IL-3 10 ng/mL，IL-6 10 ng/mL）的24 孔低吸附板，放入37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.3 小鼠骨髓造血干/祖細胞集落形成能力的檢測

將小鼠半固體集落培養基（M3434）加入24孔低吸附板中，避免產生氣泡，然后將細胞以5×103/孔的密度接種到24孔板，放入37℃、5% CO2培養箱中培養；7 d后，在顯微鏡下對形成的造血集落形成單位（colony-forming unit，CFU）進行計數；14 d 后，對高增殖潛能集落形成單位（high-proliferative-potential CFU，HPP-CFU）進行計數。

1.4 小鼠骨髓造血干/祖細胞表面標志的檢測

將分離得到的小鼠骨髓細胞用紅細胞裂解液處理后，取2×106細胞，用100 μL PBS 重懸至1.5 mL EP管中，加入抗體（Lineage、Sca-1、c-Kit），充分混勻后置于旋轉混合器上，4℃避光孵育30 min，然后用PBS 洗滌細胞2 次，800 r/min 離心5 min，用300 μL PBS重懸細胞，轉移至流式管中，用BD流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 小分子化合物Me6 對小鼠骨髓細胞集落形成能力的影響

C57BL/6 小鼠皮下注射Me6，劑量為5 mg/kg，12 h后分離小鼠骨髓單個核細胞，進行集落形成能力的檢測。7 d后，對2組骨髓細胞的造血CFU進行計數比較，由結果（圖1A）看出，與Con 組小鼠（87.67±4.096）相比，Me6 組小鼠（108.0±2.646）骨髓單個核細胞所形成的集落數顯著增加（P=0.014）；14 d后，對HPP-CFU進行計數比較，由結果（圖1B）看出，Me6組（18.75±1.109）小鼠HPP-CFU的數量較Con 組（14.33±0.667）也明顯增加（P=0.0269）。這組結果表明Me6 能增加小鼠骨髓中造血祖細胞的數量。

2.2 小分子化合物Me6 對小鼠骨髓中造血干/祖細胞的比例及數量的影響

圖1 Me6能增加小鼠骨髓中造血祖細胞的數量

將分離得到的Con組和Me6組小鼠骨髓單個核細胞進行流式細胞術分析，考察造血干/祖細胞的表面標志lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）的表達情況。檢測結果（圖2）顯示，與Con組（0.1412±0.01535）小鼠相比，Me6 組（0.2451±0.04030）小鼠骨髓中造血干/祖細胞的比例顯著增加（P=0.0337）。

2.3 小分子化合物Me6 對體外培養的小鼠骨髓單個核細胞的影響

體外分離小鼠骨髓單個核細胞，在培養體系中添加小分子化合物Me6，培養4 d 后，對Con 組和Me6組細胞總數進行比較。結果（圖3）顯示，2組細胞的細胞總數沒有顯著差別（P=0.3769）。

2.4 小分子化合物Me6 對體外培養的小鼠骨髓單個核細胞的集落形成能力的影響

圖2 Me6能增加小鼠骨髓中造血干/祖細胞的比例

圖3 培養4 d的骨髓單個核細胞的數量

將在體外分離培養的小鼠骨髓單個核細胞分為Con組和Me6培養組，取培養4 d的細胞進行集落形成能力的檢測。7 d后，對Con和Me6兩組細胞的造血CFU 進行計數比較，由結果（圖4A）看出，與Con組（81.75±3.568）相比，Me6 組（120.8±5.023）所形成的集落數增加（P=0.0007）；14 d 后，對HPP-CFU 進行計數比較，由結果（圖4B）看出，Me6 組（19.67±1.202）HPP-CFU的數量較Con組（14.25±1.436）也明顯增加（P=0.0406）。這組結果表明化合物Me6能增加體外培養的骨髓單個核細胞中造血祖細胞的數量。

2.5 小分子化合物Me6 對體外培養的小鼠骨髓單個核細胞中造血干/祖細胞增殖能力的影響

將在體外分離培養的小鼠骨髓單個核細胞分為Con 組和Me6 組，進行流式細胞術分析造血干/祖細胞（lin-Sca-1+c-Kit+）的增殖情況。檢測結果（圖5）顯示，與Con 組（0.009625±0.001216）相比，Me6 組（0.01515±0.0007304）造血干/祖細胞中Ki-67的比例增加（P=0.0176）。這說明化合物Me6能促進體外培養的骨髓單個核細胞中造血干/祖細胞的增殖。

3 討論

造血干/祖細胞是研究最為深入的成體干細胞，它具有自我更新以及分化成各系成熟血細胞的能力。在成體內，造血干/祖細胞主要定居于骨髓中。骨髓中的造血干/祖細胞不斷地增殖分化形成各種血細胞，并和各種血細胞不斷地在骨髓和外周血之間循環[1-2]。如今，造血干/祖細胞移植可以用來治療多種血液疾病，但由于獲得的造血干/祖細胞數量有限（如臍帶血中的造血干/祖細胞數量較少），直接影響了移植的效率，因此需要對造血干/祖細胞進行擴增[4]。當前用于造血干/祖細胞擴增的方法很多，包括細胞因子、高通量篩選得到的小分子化合物、基質細胞等[7,12]。體外擴增使細胞脫離了體內的微環境，可能會增加細胞的凋亡；此外，擴增可以使細胞數量增多，但有可能增加的是成熟細胞而不是干細胞，擴增后造血干/祖細胞的長期植入能力可能并未得到提高[13]。因此，對造血干/祖細胞的擴增，需要的不僅僅是表型，還有功能性的提高，使其移植后能快速有效地重建患者的造血和免疫系統。

圖4 培養4 d的骨髓單個核細胞中造血祖細胞的數量

圖5 培養4 d的骨髓單個核細胞中造血干/祖細胞的Ki-67+比例

我們的前期研究表明Me6 具有很好的動員作用，能將骨髓中造血干/祖細胞動員至外周血中，增加外周血中造血干/祖細胞的比例及數量[6]。在本研究中，我們發現Me6還能促進小鼠骨髓造血干/祖細胞的增殖。對實驗小鼠皮下注射Me6，12 h 后檢測小鼠的骨髓，可發現骨髓細胞的集落形成能力增強，并且造血干/祖細胞的比例及數量也有所增加。這些結果提示該化合物在動員造血干/祖細胞的同時，可能促進了骨髓造血干/祖細胞的擴增。我們的芯片檢測結果也提示化合物可能調節了Notch 信號通路，文獻報道該通路具有促進造血干/祖細胞擴增的能力[14-16]。為進一步確定化合物Me6 是否具有體外促進造血干/祖細胞擴增的能力，我們在體外分離培養了小鼠骨髓單個核細胞，向培養體系中加入化合物Me6，培養4 d后Me6組細胞的集落形成能力及增殖的造血干/祖細胞的比例都增加了，這些結果提示Me6 具有體外促進造血干/祖細胞擴增的能力。對于小分子化合物Me6 是否能促進造血干/祖細胞的長期擴增及其可能的機制仍須進行深入的研究。

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