雌激素受體α磷酸化位點突變體T224A和S559A的構建及其轉錄激活活性檢測

陳偉 ，周鵬宇，朱永杰，馬勝利，曹葉,4，張萍萍,5，何湘，魏從文，鐘輝，吳飛翔

1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院 肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；3.安徽大學 健康科學院，安徽 合肥 230039；4.吉林大學 分子酶學工程實驗室，吉林 長春 130012；5.濟南軍區總醫院 實驗檢驗科，山東 濟南 250031

乳腺癌是現代女性最常見的腫瘤之一，它的發生發展和許多因素相關，其中與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的關系最為密切[1-2]。ER屬于類固醇核受體，包括ERα和ERβ兩個亞型，ERα促進乳腺癌的發生發展，而ERβ抑制乳腺癌的發生[3-4]。目前關于ERα的研究相對較多。ERα含595個氨基酸殘基，相對分子質量約為66×103，包含5 個結構域，依次為不依賴配體激活的AF1、負責與靶基因啟動子的雌激素反應元件（estrogen receptor elements，ERE）特異結合的DNA 結合域（DNA binding domain，DBD）、核定位信號的鉸鏈區、配體結合功能區（ligand-binding domain，LBD）和配體依賴轉錄的AF2，以及功能不詳的可變區[5-7]。ERα常發生翻譯后修飾，如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化、SUMO、棕櫚化，其中以磷酸化最為常見。現已報道的ERα磷酸化位點有十幾個，其中研究比較透徹的有7個，為S104、S106、S118、S167、S236、S305 及Y537[8-9]。不同區域磷酸化對ERα的作用也不同，如DBD區的S236 位點在蛋白激酶A 作用下發生磷酸化，從而抑制ERα二聚化形成，阻斷其與DNA 的結合；而由Src酪氨酸激酶介導的Y537 磷酸化主要調節ERα與E2的結合能力[10-11]。這些翻譯后修飾常常調節ERα與ERE的結合，從而激活或抑制下游基因的轉錄，包括c-myc、BCL-2、Bcl-XL、Cyclin D1、IL-8，這些下游基因與乳腺癌的發生、發展有著密切的關系[12-13]。因此，ERα翻譯后修飾常為乳腺癌研究的重點和熱點。

本課題組前期在乳腺癌相關研究中，通過質譜分析發現在ERα DBD 區224 位蘇氨酸（T224）和可變區559 位絲氨酸（S559）發生磷酸化。雖然559 位絲氨酸發生磷酸化已有報道，但對其研究尚少[9]，而224 位蘇氨酸磷酸化尚無報道。為此，我們構建了ERα 224 位蘇氨酸、559 位絲氨酸磷酸化突變點載體，通過螢光素酶報告基因方法檢測這些突變位點對ERα活性是否產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T 細胞、感受態大腸桿菌DH5α、pRL 質粒、ERE 啟動子的螢光素酶報告基因質粒（EREluc）及pcDNA3-Flag 均為本實驗室保存；真核表達質粒pcDNA3-Flag-ERα為本實驗室構建保存；引物合成及測序由奧科鼎盛生物技術公司完成；限制性內切酶、T4DNA連接酶等購自TaKaRa公司；高保真PfuDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Tiangen 公司；螢光素酶活性測定試劑盒購自Promega公司；DMEM培養基購自Gibco生物公司；胎牛血清購自杭州江濱公司；轉染試劑LipofectAMINE 2000 購自Invitrogen 公司；鼠抗Flag 抗體購自Santa Cruz公司；雌激素、HRP標記的鼠抗微管蛋白抗體購自Sigma 公司；HRP 標記的羊抗鼠購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 擴增突變片段

利用重組PCR擴增ERα（T224A）、ERα（S559A）突變片段，即ACC突變為GCC、TCC突變為GCC。根據ERα基因序列及點突變需要設計引物（表1），由奧科鼎盛生物技術有限公司合成。

以本實驗室構建保存的野生型ERα質粒為模板，用相應的引物，通過PCR 擴增出含有點突變的上、下游目的基因片段（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，進行30 個循環；68℃延伸7 min），經瓊脂糖凝膠電泳及上、下游片段回收，以等摩爾比例的上、下游配對片段為共同模板，利用搭橋法進行二次PCR（擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸120 s，進行30 個循環；68℃延伸7 min），擴增出點突變的全長目的基因片段。

1.3 構建磷酸化位點突變載體

把全長點突變片段、pcDNA3-Flag 質粒分別用限制性內切酶BamHⅠ/EcoRⅠ于37℃雙酶切過夜，利用瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段和質粒，再以6∶1（片段∶質粒）的比例混合，室溫連接10 min后把連接產物直接轉化大腸桿菌DH5α，在氨芐西林培養板上于37℃培養過夜，篩選陽性克隆，以陽性克隆為模板再次行PCR，確定重組質粒上含有目的基因片段后，送奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

1.4 細胞培養及轉染

用含10%胎牛血清、200 U/mL 青霉素、200 U/mL鏈霉素的DMEM培養基，在5% CO2、37℃的培養箱中培養HEK293T細胞，當細胞長至10 mm培養皿的60%～80%時用于轉染，轉染前1 h 更換4 mL 新鮮培養基。先把4 μg 構建的質粒、4 μL 轉染試劑LipofectAMINE 2000 分別加入200 μL 生理鹽水中混合，靜置5 min，把混有轉染試劑的生理鹽水加入混有質粒的生理鹽水中，靜置15 min，均勻地加入培養基中，4 h后補4～6 mL新鮮培養基。

1.5 免疫印跡分析

轉染24 h 后收集細胞，加入SDS 上樣緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，0.1%溴酚藍，2%SDS，10%甘油，2.5% β-巰基乙醇），沸水浴10 min，離心10 min 后取上清進行SDS-PAGE，電泳結束后轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h 或4℃過夜，然后加入稀釋的Flag 抗體，室溫孵育1 h或4℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3次，每次5 min，再加入稀釋的帶有辣根過氧化物酶偶聯的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，再次用1×TBST洗膜3次，每次5 min，然后將含有辣根過氧化物酶底物的ECL 滴加至膜上，隨即在暗室中壓片顯影。

表1 引物及序列

1.6 螢光素酶報告基因檢測

把HEK293T 細胞接種到6 孔板培養，用無指示劑的白色DMEM培養基培養24 h，等長至60%～80%時進行轉染。實驗組設立分別為：①pcDNA3-Flag（1 μg/孔）；②pcDNA3-Flag-ERα質粒（1 μg/孔）；③pcDNA3-Flag-ERα（T224A）突變質粒（1 μg/孔）；④pcDNA3-Flag-ERα（S559A）突變質粒（1 μg/孔）。以上組均與ERE-luc 質粒（0.8 μg/孔）、pRL 質粒（0.008 μg/孔）共轉，培養基中加入或不加入雌激素（10 nmol/L），共8組，每組設3個復孔。培養24 h后進行螢光素酶報告基因檢測。先用1×PBS洗滌細胞2 次，再向各孔中加入100 μL 細胞裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，把細胞裂解物收集到1.5 mL離心管中，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取30 μL 上清用于螢光素酶活性測定。

1.7 統計學分析

實驗數據用SPSS13.0統計學軟件處理，采用t檢驗進行統計學分析。顯著性概率水平定為P＜0.05。

2 結果

2.1 ERα T224A、S559A突變基因片段的擴增

以pcDNA3-Flag-ERα質粒為模板，通過重組PCR 擴增點突變的上、下游片段。經電泳鑒定（圖1），T224A上、下游片段為600～1000 bp，S559A上游約1700 bp，下游約100 bp；再以配對上、下游片段為共同模板，二次PCR擴增出全長的突變基因片段，均約1800 bp。

2.2 ERα T224A、S559A突變質粒構建

將T224A、S559A 突變體擴增產物和pcDNA3-Flag質粒均用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切，回收，連接后轉入大腸桿菌DH5α，用氨芐西林培養板培養。以陽性克隆菌液為模板，重復PCR 檢測質粒中是否含有目的基因片段。電泳結果如圖2，PCR 產物約1800 bp，證明質粒上含有目的基因片段。測序結果進一步證明插入片段為ERα突變體片段（序列略）。

2.3 Western印跡檢測ERα突變體的表達

圖1 瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增ERα突變體產物

分別將pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）及對空載體對照pcDNA3-Flag質粒轉染HEK293T細胞，培養24 h后收集細胞，用抗Flag 抗體檢測pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的表達，Western 印跡結果如圖3。與空載體對照組相比，轉染pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的細胞，均顯示有一條相對分子質量約66×103的特異性條帶，與預期大小吻合，說明pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）在HEK293T細胞中均獲得良好表達。

2.4 螢光素酶報告基因檢測突變體活性

圖2 突變體表達質粒的PCR鑒定

圖3 ERα及突變體的Western印跡檢測

圖4 ERα及其突變體在有或無E2時的轉錄激活活性檢測

將pcDNA3-Flag、pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）、pcDNA3-Flag-ERα（S559A）分別與ERE-luc 和pRL 共轉入HEK293T 細胞，用無指示劑的DMEM培養基培養24 h后收集細胞，行螢光素酶活性檢測，結果如圖4。無雌激素時，pcDNA3-Flag-ERα、pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性分別是pcDNA3-Flag 的1.94、1.49 和1.84 倍（P＜0.05）；與pcDNA3-Flag-ERα（T224A）相比，pcDNA3-Flag-ERα和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）的活性明顯減低（P＜0.05），pcDNA3-Flag-ERα（S559A）與pcDNA3-Flag-ERα的活性差異不顯著（P＜0.05）。有雌激素時，pcDNA3-Flag 活性增加了0.54 倍，pcDNA3-Flag-ERα活性增強了1.57 倍，而pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）活性分別增強了0.54 和0.61 倍，說明在雌激素作用下，pcDNA3-Flag-ERα活性增強明顯高于pcDNA3-Flag-ERα（T224A）和pcDNA3-Flag-ERα（S559A）（P＜0.05）。因此，在HEK293T 細胞中，224 位蘇氨酸的磷酸化修飾對ERα活性起著重要的作用，同時2 個磷酸化位點對雌激素調節ERα的活性也發揮重要作用。

3 討論

ERα與乳腺癌的發生、發展、轉移和治療效果密切相關，因此乳腺癌的內分泌治療主要以ERα介導的通路為靶點，如氟維司群（fulvestrant）抑制ERα的表達；他莫昔芬（tamoxifen）競爭性結合ERα，減少雌激素與ERα結合[14-15]。但在臨床上內分泌治療常常出現耐藥性，這些耐藥性常與翻譯后修飾有關，其中以磷酸化最為常見[2]，因此，研究ERα的磷酸化對探討耐藥機制及藥物開發都有重要意義[16-17]。

有關ERα磷酸化的研究很多，已報道有十幾個磷酸化位點分布在各個區域，其中研究較透徹的位點有7 個，包括AF1 區的S104、S106、S118、S167，DBD 區的S236，LBD 區的S305 及AF2 區的Y537。前期我們通過質譜分析發現，ERα在DBD 區的224位蘇氨酸和可變區的559 位絲氨酸發生磷酸化，而目前關于559位絲氨磷酸化的研究甚少，而224位蘇氨酸磷酸化的研究尚無報道。我們通過構建ERα 224 位蘇氨酸、559 位絲氨磷酸化位點突變體，利用螢光素酶報告基因活性檢測法檢測其活性的改變，發現224位蘇氨酸突變體活性減弱，而559位絲氨突變體對雌激素調控減弱。這可能與224位蘇氨酸處于DBD 區有關，該區主要負責與靶基因啟動子的ERE 結合，發生突變后可能與ERE 的結合能力減弱，從而使ERα活性減弱[18]。可變區功能研究尚未清楚，因結構上與AF2區相鄰，可能與AF2區有相似的依賴配體調節ERα活性功能。因此，可變區的559 位絲氨突變后，ERα也發生受雌激素調控減弱，但需要進一步研究驗證。總之，ERα磷酸化位點突變體的構建及其活性的檢測，對ERα的研究有重要意義，對乳腺癌的研究也可提供一定的幫助。

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