基于微流控芯片的尿酸和抗壞血酸并行電化學檢測研究*

徐 征，陸佳慶，Morimoto Ryo，劉軍山，胡帥龍

（大連理工大學遼寧省微納米技術及系統重點實驗室，遼寧大連116024）

基于微流控芯片的尿酸和抗壞血酸并行
電化學檢測研究*

徐 征*，陸佳慶，Morimoto Ryo，劉軍山，胡帥龍

（大連理工大學遼寧省微納米技術及系統重點實驗室，遼寧大連116024）

尿樣和血樣中的尿酸水平是診斷痛風等疾病的重要指標，傳統檢測方法存在時間長、需要其他輔助試劑等不足，開展了在微流控芯片上對尿酸進行電化學檢測的研究：以碳納米管修飾的絲網印刷電極片為檢測單元，構建了PDMS微流控芯片。以微流控芯片為平臺，采用微分脈沖伏安法（DPV）對尿酸和抗壞血酸分別進行檢測，確定其原始峰值電位。最后，實驗測試和分析比較了不同濃度尿酸和抗壞血酸對電化學檢測信號的影響。研究結果表明：用DPV法分別檢測尿酸和抗壞血酸，測得峰電流與樣品濃度均有較好的線性度；從并行檢測信號中能夠分辨出尿酸和抗壞血酸的氧化峰位；尿酸和抗壞血酸對彼此的DPV峰位無明顯影響，但對DPV電流峰值有一定抑制作用。

微流控芯片，電化學檢測，微分脈沖伏安法，尿酸

尿酸（Uric aAcid，UA）是嘌呤代謝的產物，正常人體尿酸約1 200 mg，負責體內羥基自由基和單態氧的還原。但當代謝異常等引起體內尿酸濃度升高時，會導致尿結石、痛風等疾病，尿酸水平已成為診斷痛風的重要指標［1-3］。目前臨床上采用酶促反應和吸收光度法測量尿酸濃度，其不足是需要多種輔助試劑和檢測時間較長［4］。電化學方法通過測定電化學氧化還原反應中電荷傳遞來確定物質種類和濃度，具有靈敏度高、響應速度快等特點，不需要使用透鏡等光學元件［5-6］。但由于血樣和尿樣中往往存在與尿酸化學特性相近的多種抗氧化物，會對尿酸檢測信號有干擾。近年來，人們針對電化學檢測尿酸的靈敏度和特異性開展研究，發現利用納米材料改性電極能夠有效從樣品中測得尿酸含量。例如：Sun等通過循環伏安法并行檢測尿酸等，發現石墨烯/Pt復合修飾的電極在檢測特異性和線性方面優于裸碳電極［7］。Sheng等使應用微分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）同時測試尿酸等物質，其尿酸檢測靈敏限可達5.0 μmol·L-1［8］。

微流控技術是指在平方厘米大小的基片上集成多種功能單元，形成微流控芯片。將電化學檢測方法與微流控技術相融合，能夠減少樣品量、縮小儀器體積、提高檢測速度［9］，常用的制造微流控芯片材料包括玻璃以及各種聚合物，其中聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）在微流控芯片制造中使用最為廣泛，具有制造簡單、耐腐蝕、無毒性等優點。然而，制造電化學檢測芯片需要在芯片上集成微細電極，但PDMS比表面能低（表面張力20.6 mN·m-1［10］），其熱膨脹系數也與金屬差異大（PDMS：3.1×10-6m·K-1，Pt：8.8×10-4m·K-1［11］）。這樣，通過濺射、沉積等MEMS工藝在PDMS表面制作電極極易出現斷裂和褶皺現象，器件成品率低。Qiu等研制了一種用于尿酸等電化學檢測的PDMS微流控芯片，首先對微溝道內的樣品進行電泳分離，然后在微溝道出口處進行電化學檢測，對尿酸和抗壞血酸的檢測靈敏度分別為20 μmol·L-1和3.6 μmol·L-1，但芯片中的三電極體系是利用碳纖維和金屬絲構建的，組裝復雜，電極一致性難以保證［12］。另一種解決途徑是在玻璃或其他熱塑性聚合物表面制造電極圖形，然后與具有微溝道結構的PDMS片組合形成復合微流控芯片［13-14］，但由于電極薄膜具有百納米級的凸起厚度，這會導致在電極區域附近出現密封不完全等問題，在使用中容易產生氣泡和漏液。

本文針對上述問題，提出了一種利用碳納米管修飾的絲網印刷電極片構建PDMS微流控芯片的新方法，通過增加中間膠合層解決了電極區域的密封問題，降低了芯片制造難度。采用DPV法在芯片中對尿酸和抗壞血酸進行了并行測試，最后分析了抗壞血酸含量對尿酸檢測信號的影響。

1 實驗設備及檢測方法

1.1 微流控芯片設計與制作

圖1 芯片

如圖1（a）所示，芯片由具有微溝道結構的蓋片、含電化學檢測電極的基片和中間膠合層組成，其中微溝道寬度500 μm，反應區寬5 mm、長1 cm，采用PDMS材料制備。采用碳納米管修飾的絲網印刷電極片（110CNT-GNP，Dropsens）作為電化學檢測電極，其工作電極表面修飾有碳納米管材料，起增強電荷傳導和擴大接觸面積的作用，如圖1（a）所示，工作電極的直徑為4 mm。對電極是與工作電極間隔0.75 mm的一段圓環，它的材料是碳，參考電極為銀電極。為避免電極表面高出基片表面引起的鍵合不完全問題，本文選擇了膠合法封接芯片，膠合層采用聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）雙面膠。芯片制造步驟如下：

①基片模具制造。基片模具是利用SU8膠光刻固化成型制造的，過程如下：在拋光玻璃片上甩80 μm厚的SU8膠；前烘60分鐘（80℃）；曝光30 s（MA/BA6，SUSS MicroTec）；后烘45分鐘（80℃）；顯影去膠，得到微溝道的反模結構。基片成形：將混合均勻、除氣充分的PDMS原液（Sylgard184，Dow Corning）傾倒于基片模具上，固化80分鐘（70℃），手工脫模和打儲液池孔，獲得基片。

②蓋片成形。將電極片相同尺寸的金屬片粘接在拋光玻璃片上形成蓋片模具，澆注PDMS原液，固化脫模，獲得蓋片。

③中間膠合層加工。利用開模工具在PET雙面膠開與檢測區域相近的通孔。

④封接。將上述部件在顯微鏡下對準和加壓封接，獲得芯片，如圖1（b）所示。

1.2 電化學檢測設備與材料

尿酸在電位適宜的條件下會被氧化成尿囊素，該反應一般看作不可逆反應。對于抗壞血酸，它與其氧化產物脫氫抗壞血酸有平衡關系。然而，由于脫氫抗壞血酸和水結合后分解，會生成二酮古洛糖酸，而二酮古洛糖酸是難以還原的物質，這樣抗壞血酸的氧化反應也是近似不可逆的［15，16］。由于二者的電化學反應均不可逆，采用伏安循環法并不能測到還原峰，因此本文選擇微分脈沖伏安法檢測尿酸和抗壞血酸。檢測儀器是CHI650E電化學分析儀（上海辰華），掃描電壓范圍為0.05 V～0.8 V，掃描增量為0.005 V，掃描周期為0.5 s，掃描脈沖寬度為0.05 s，掃描靈敏度為1 μA/V。樣品溶液是在PBS緩沖液基礎上配置的，PBS緩沖液采用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置，pH值為3，配置溶液所用尿酸和抗壞血酸從大連美侖生物公司購買。

2 實驗結果與分析

2.1 抗壞血酸和尿酸電化學特性的DPV測試

本文利用同一芯片和相同的檢測參數，分別對不同濃度的尿酸和抗壞血酸進行檢測，首先將待測溶液注入芯片，待樣品分布基本穩定后開始電化學掃描。

圖2是對于不同濃度的尿酸掃描檢測結果，尿酸濃度范圍為0.1 mmol·L-1～0.4 mmol·L-1?？芍耗蛩岬母叻咫娢换九c尿酸濃度無關，均保持在0.35 V左右，變化范圍在0.01 V內。圖2顯示了是不同濃度的尿酸與氧化峰電流絕對值的對應關系，擬合可得到Ipa=4.14CUA+0.35，R=0.996（相關系數）。

圖2 不同濃度的尿酸檢測結果

圖3是對于不同濃度的抗壞血酸掃描檢測結果，抗壞血酸濃度范圍為0.01 mmol·L-1～1.00 mmol·L-1。當濃度低于0.025 mmol·L-1時，無法分辨出有效氧化峰；抗壞血酸的高峰電位與其濃度無關，保持在0.2 V左右，變化范圍在0.04 V之內。圖3給出了不同濃度的抗壞血酸與氧化峰電流對應關系，擬合可得到Ipa=1.91CAA+0.63，R=0.994（相關系數）。

圖3 不同濃度的抗血壞酸檢測結果

2.2 抗壞血酸和尿酸的DPV法并行檢測

DPV法能夠檢測到不同濃度尿酸和抗壞血酸的電化學響應，本節在兩種溶液混合條件下對其電化學特性進行檢測。實驗分別對不同濃度的尿酸和抗壞血酸的混合溶液檢測，將待測溶液注入芯片，在樣品分布基本穩定后開始電化學掃描。本文對于檢測溶液調配固定尿酸濃度分別為0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1，在同種濃度尿酸溶液中改變抗壞血酸的濃度，分別從0.025 mmol·L-1到0.1 mmol·L-1不等。

從圖4可以觀察到在不同濃度的尿酸溶液中檢測中，在檢測電壓范圍內都存在兩個明顯的峰值，且兩個峰沒有重疊。尿酸的高峰電位為0.35 V，不同濃度下高峰電位的差異在0.05 V以內；抗壞血酸的高峰電位在0.2 V左右，隨著抗壞血酸濃度的增加，高峰電位有所增加，變化也在0.05 V之內。與尿酸和抗壞血酸單獨檢測的結果對比，兩者的高峰電位基本不變，這說明抗壞血酸的加入對尿酸的高峰電位沒有影響，反之亦然。

并行檢測時尿酸和抗壞血酸的高峰電流差值如表1所示。對比分別對尿酸和抗壞血酸的獨立檢測的結果，尿酸的高峰電流差值從分別檢測時的1.2 μA降低到0.94 μA；抗壞血酸的高峰電流差值從分別檢測時的0.3 μA降低到0.14 μA。說明在并行檢測尿酸和抗壞血酸時，兩者的檢測信號是存在相互干擾的。尿酸的存在對抗壞血酸的檢測信號有抑制作用，在尿酸濃度為0.3 mmol·L-1時抑制效果最明顯，此外抗壞血酸的存在對尿酸的檢測信號也有抑制作用，這種作用在抗壞血酸濃度為0.075 mmol·L-1時最明顯。

圖4 尿酸和抗壞血酸并行檢測的結果

表1 尿酸和抗壞血酸的高峰電流差值

進一步比較尿酸和抗壞血酸同時檢測時兩者高峰電流與濃度的關系，如圖5所示。

圖5

尿酸濃度與高峰電流之間呈現了函數關系，在各濃度抗壞血酸中，尿酸濃度與高峰電流的線性相關系數R分別為0.933、0.918、0.938、0.926，均小于0.99，表明抗壞血酸的加入對于尿酸濃度與高峰電流值之間的線性關系是有影響，當尿酸濃度為0.1 mmol·L-1時對線性關系的影響最大。這是由于在并行檢測尿酸和抗壞血酸時，由低到高依次掃描的，而抗壞血酸的反應電位低于尿酸，所以抗壞血酸會先反應，其產物吸附于電極表面，從而部分抑制了尿酸的反應。抗壞血酸濃度與其高峰電流值在不同濃度尿酸檢測條件下仍呈近似線性關系，不同尿酸濃度下，相關系數R都接近于1，分別為0.997、0.994、0.995、0.998，與單獨檢測抗壞血酸時的現象相似。但是，與單獨檢測相比，曲線的擬合斜率有波動，從1.91分別變為1.95、4.6、1.65、2.26。

3 結論

①以碳納米管修飾的絲網印刷電極片為檢測單元，構建了PDMS微流控芯片，通過增加中間膠合層解決了電極區域的密封問題。

②以微流控芯片為平臺，采用DPV法對尿酸和抗壞血酸分別進行檢測，發現尿酸的氧化峰出現在0.35 V，而抗壞血酸的氧化峰出現在0.2 V。對兩種物質，氧化峰的電位均與樣品濃度無關，而高峰電流值與樣品濃度呈現線性相關性。

③研究了并行檢測中尿酸和抗壞血酸的相互干擾作用，發現能夠從DPV掃描信號中分辨出尿酸和抗壞血酸的氧化峰位；尿酸和抗壞血酸對彼此的DPV峰位無明顯影響，但對DPV電流峰值有一定抑制作用。

本文為尿酸等人體抗氧化物質的快速和低成本檢測提供了一種可行的方法。

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徐 征（1973-），男，河南鄭州人，博士，副研究員，1997年于吉林工業大學獲得學士學位，2000年于吉林工業大學獲得碩士學位，2004年于大連理工大學獲得博士學位，主要從事微納制造和微納流體等研究工作，xuzheng@dlut.edu.cn；

陸佳慶（1989-），女，碩士，研究方向為微機電系統。

Simultaneous Electrochemical Detection of Uric Acid and Ascorbic Acid with Microfluidic Chips*

XU Zheng*，LU Jiaqing，Morimoto Ryo，LIU Junshan，HU Shuailong
（Key Laboratory for Micro/Nano Technology and System of Liaoning Province，Dalian University of Technology，Dalian Liaoning 116024，China）

Uric acid（UA）level in urine and blood serum can be used to diagnose several diseases such as gout.However conventional methods based on enzymatic reaction and colorimetric techniques require a long time and a great amount of cost for other reagents.Electrochemical detection of uric acid with microfluidic chips was developed：A PDMS microfluidic chip with a screen-printed electrode plate modified by carbon nano-tubes was fabricated.With the chip，UA and ascorbic acid（AA）were detected using differential pulse voltammetry（DPV）method.The effect of UA and AA on the electrochemical responses was experimentally investigated and analyzed.The results showed that：The oxidation peak current was proportional to the concentration of UA and AA over the detection range respectively.For simultaneous detection of UA and AA，two well-separated voltammetric peaks could be obtained in various levels of concentration.Both UA and AA had no significant effect on the position of voltammetric peak，but restrained each other’s peak currents.

microfluidic chip；electrochemical detection；differential pulse voltammetry；uric acid

O657.1；R318.08

A

1004-1699（2015）08-1103-05

??2575；7320T

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.08.001

項目來源：遼寧省教育廳重點實驗室基礎研究項目（NO.LZ2014005）中央高?；究蒲袠I務費專項資金（NO.DUT14LAB07）

2015-03-14 修改日期：2015-05-16