機械灌注技術(shù)在臨床肝移植的應(yīng)用

【作者】任馮剛，朱皓陽，嚴小鵬，劉暢，張曉剛，呂毅

1 西安交通大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，西安市，710061

2 西安交通大學先進外科技術(shù)與工程研究所，西安市，710061

3 陜西省再生醫(yī)學與外科工程技術(shù)研究中心，西安市，710061

機械灌注技術(shù)在臨床肝移植的應(yīng)用

【作者】任馮剛1,2,3，朱皓陽1,2,3，嚴小鵬1,2,3，劉暢1,2,3，張曉剛1,2,3，呂毅1,2,3

1 西安交通大學第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，西安市，710061

2 西安交通大學先進外科技術(shù)與工程研究所，西安市，710061

3 陜西省再生醫(yī)學與外科工程技術(shù)研究中心，西安市，710061

肝移植是當前治療終末期肝病唯一的有效手段。近年來為解決供體短缺問題，邊緣供體被大量應(yīng)用，隨之也帶來一系列問題。機械灌注技術(shù)可以模擬在體條件下肝臟生理循環(huán)狀態(tài)，有利于離體肝臟保護，減少術(shù)后并發(fā)癥的風險，是近年來器官保存的研究熱點。該文就當前應(yīng)用于臨床肝移植的機械灌注技術(shù)現(xiàn)狀及前景進行綜述分析。

肝移植；器官保存；機械灌注

0　引言

肝移植是治療終末期肝病唯一的有效手段。自上世紀六十年代以來，臨床肝移植得到迅猛發(fā)展，從器官獲取、離體保存到圍手術(shù)期管理都取得了長足進步[1]。一直以來，單純低溫保存（Simple C°ld St°rage, SCS）是肝臟保存的金標準，可以在一定程度上延長供體器官壽命[1-2]。隨著擴大標準供體（Extended Criteria D°n°r, ECD）的大量應(yīng)用，傳統(tǒng)保存方式已經(jīng)無法滿足器官保存的需要[3–6]。機械灌注（Machine Perfusi°n, MP）技術(shù)早在上世紀三十年代就被人提出，近十年來又逐漸引起人們重視，并已在腎臟保存領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1,3-4]。目前應(yīng)用于臨床肝移植的機械灌注技術(shù)尚未成熟，國外雖已有眾多肝臟機械灌注方案，但都仍處于臨床試驗階段，尚未大規(guī)模應(yīng)用[2,5]。已有可靠的研究證實應(yīng)用機械灌注對離體肝臟進行保存可以有效擴大供體池，降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率[5, 7]。

1　機械灌注技術(shù)及設(shè)備

機械灌注是指在器官離體后通過帶有轉(zhuǎn)動泵、控溫裝置、控壓裝置、氧合裝置及計算機控制裝置的設(shè)備用離體保存液或灌注液進行體外循環(huán)灌注的一項器官保存技術(shù)[2]。早在1935年，Carrel A就在實驗室完成了近900例機械灌注實驗，盡管大部分都是比較小的人體組織，但其所采用的方法已經(jīng)與當代所用機械灌注方法類似：循環(huán)灌注，氧合滲透及壓力控制[8-9]。原始Lindbergh–Carrel灌注泵實物見圖1。在1968年，Belzer FO首次使用低溫機械灌注設(shè)備成功將人類腎臟保存期延長至17 h[10]。

圖1　原始Lindbergh–Carrel灌注泵實物[8]Fig.1 The °riginal Lindbergh–Carrel perfusi°n pump[8]

在2000年之前，機械灌注并未引起人們太多重視，一方面因為機械灌注對于設(shè)備技術(shù)要求較高，而單純低溫冷凍保存因為器官保存液的發(fā)展日漸成熟，也相對便宜；另一方面，腦死亡供體(D°n°r after Brain Death, DBD)取代心臟死亡供體(D°n°r after Cardiac Death, DCD)成為供體的主要來源，而低溫保存液對于DBD供體保存效果相對較好[9,11]。近十年來，邊緣供體特別是DCD供體又更多應(yīng)用于器官移植，機械灌注技術(shù)才逐漸引起人們重視[1,2,9,11]。2009年，Pl°eg RJ教授[3]團隊首次通過一項包含336對多來源腎臟的隨機對照試驗證實，低溫機械灌注相對于單純低溫保存可以有效降低腎移植術(shù)后一年移植腎功能延遲恢復(fù)（Delayed Graft Functi°n, DGF）發(fā)生率，同時提高移植物存活率。自此，機械灌注逐漸廣泛應(yīng)用于腎臟移植領(lǐng)域，類似于LifeP°rt這樣的離體腎臟機械灌注設(shè)備已經(jīng)得到成功的商業(yè)化推廣[1,3-4]。在2014年，Guarrera JV教授[5]團隊首次完成了肝臟機械灌注保存的隨機對照研究，這項研究中證實低溫機械灌注可以有效降低早期移植物失功能（Early All°graft Dysfuncti°n, EAD）的發(fā)生。LifeP°rt腎臟器官保存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實物和肝臟機械灌注系統(tǒng)原型機見圖2。

圖2　腎臟器官保存轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和肝臟機械灌注系統(tǒng)Fig.2 Kidney transp°rter f°r °rgan rec°very systems and the pr°t°type °f liver machine perfusi°n system

機械灌注設(shè)備在設(shè)計及制造上并不復(fù)雜。類似于臨床上使用的血液透析設(shè)備及血漿置換設(shè)備，他們都是通過體外裝置模擬人體內(nèi)的循環(huán)流動，從而為離體器官供給所需的能量并清除循環(huán)廢物。設(shè)備的核心元件主要是轉(zhuǎn)動泵、控溫裝置、控壓裝置、氧合裝置及計算機控制裝置，關(guān)鍵問題是設(shè)定合適的運行參數(shù)以最大化滿足肝臟在離體條件下的需求，這也是目前臨床肝移植機械灌注爭論的焦點[2,6]。根據(jù)肝臟的解剖特點，有兩路管路分別連接肝臟動脈及門脈系統(tǒng)，同時還有一路管路對膽汁進行引流。氧合裝置對入路液體進行充分氧合，以使足夠的氧氣滲透進灌注液以滿足肝臟代謝；控溫裝置設(shè)定不同的環(huán)境溫度，使離體循環(huán)穩(wěn)定在恒溫狀態(tài)；計算機控制裝置通過設(shè)定不同的溫度、流速、灌注壓力等參數(shù)來整體控制機械灌注的進行。

2　特點及分類

由于單純低溫保存技術(shù)存在諸多限制，特別是無法實時評價肝臟生理狀態(tài)，對邊緣供肝保存能力的缺乏，使之成為制約肝移植進一步發(fā)展的瓶頸。機械灌注則可以有效克服目前單純低溫保存無法解決的一些問題，它具備以下特點[2]：(1) 可以提供連續(xù)的循環(huán)灌注，保持肝臟微循環(huán)穩(wěn)態(tài)；(2) 提供連續(xù)的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)以滿足器官代謝；(3) 通過灌注液實時評估器官功能狀態(tài)；(4) 引出的灌注液經(jīng)濾過后可以移除代謝廢物；(5) 通過灌注液注入細胞保護物質(zhì)及藥物等；(6) 提高移植物存活率及改善預(yù)后。

目前臨床肝臟機械灌注方案較多，國外已有數(shù)家機構(gòu)通過動物研究及小規(guī)模臨床試驗證實了其可靠性，但尚缺一個能被廣泛認可的方案。不同方案之間主要區(qū)別點在于機械灌注的環(huán)境溫度及介入時機的選擇。根據(jù)環(huán)境溫度的不同，機械灌注可分為低溫機械灌注、常溫機械灌注及亞低溫機械灌注。同時，灌注液的組分和類型也尚存爭議，灌注液的選擇也決定于灌注溫度條件。不同的灌注溫度選擇主要依據(jù)于細胞呼吸代謝曲線，單純低溫保存也正是基于這個原理設(shè)計，在0～4°C條件下細胞代謝率可以降低至正常生理狀態(tài)的5%，從而延長器官壽命[12-14]。

在低溫條件下，肝臟代謝活性最低，所需氧氣最少，可以最大程度使細胞進入休眠狀態(tài)，從而延長器官壽命[13]。但有學者認為低溫環(huán)境并不利于細胞功能的保護，從而提出完全模擬在體狀態(tài)的常溫機械灌注，這樣的條件下肝臟處于正常生理代謝狀態(tài)，需要持續(xù)的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)以滿足需要，同時肝臟代謝產(chǎn)物也需要及時分離[15-16]。亞低溫機械灌注是近來興起的新的概念，他綜合了低溫和常溫機械灌注的特點，可以保證肝臟在近似正常的生理活動的同時延長器官保存時間[17-19]。器官保存包括器官獲取、轉(zhuǎn)運、移植前再灌注三個階段，在這三個階段內(nèi)機械灌注都可以進行介入，可以是在器官保存期全程進行灌注保存，也可以是其中一個階段。不同灌注時機的選擇及灌注時長之間的優(yōu)劣目前暫無定論，但都被證實對于器官保存具有一定的作用。

3　低溫機械灌注

低溫機械灌注(Hyp°thermic Machine Perfusi°n, HMP)是目前最為成熟的機械灌注方案，并已在腎移植領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[3-4]。HMP繼承了單純低溫保存在0～10°C對器官進行保存的特點，具備很好的安全性，一旦機械灌注設(shè)備失常，離體器官仍可以在傳統(tǒng)的低溫下得到妥善保存[6,9]。在低溫條件下器官代謝率較低，可以不需要供氧或其他能量物質(zhì)，所以在灌注液的選擇上空間更大，可以選用不含紅細胞組分或攜氧組分的灌注液。但這也同時限制了對離體肝臟功能狀態(tài)的評估，特別是無法評估膽汁的生成[9,11]。

在2009年，Guarrera JV教授[20]團隊開始了第一個應(yīng)用于臨床肝移植的HMP研究。在這項研究中，20例成人接受了經(jīng)過3～7 h機械灌注后的肝臟移植，并與SCS組進行對比。結(jié)果顯示：HMP組EAD發(fā)生率為5%，SCS組為25%。HMP在這項預(yù)實驗中表現(xiàn)出較高的安全性和可靠性。在隨后的5年里，該研究團隊進行了目前開始最早，同時也是唯一已經(jīng)完成的針對臨床肝臟機械灌注保存的隨機對照研究[5]。最終的結(jié)果顯示：HMP組EAD發(fā)生率為19%，SCS組為30%（P=0.384）；1年術(shù)后生存率分別為85%和80%（無統(tǒng)計學差異）；但術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)病率HMP組明顯低于SCS組（4 vs 13，P=0.016），術(shù)后住院日HMP組也明顯低于SCS組（13.64±10.9 vs 20.14±11.12，P=0.001）。雖然這項研究僅容納了30對患者，但卻證實了HMP對于肝臟可靠的保護功能，以及可以降低術(shù)后膽道并發(fā)癥的優(yōu)勢。

Dutk°wski P教授[7]團隊則首次證實了機械灌注對于DCD供肝的保護作用。在這項研究中，DCD供體肝臟首先經(jīng)過常規(guī)的4°C低溫保存，隨后在移植前1～2 h經(jīng)門靜脈進行低溫氧合機械灌注，這項方案也被成為HOPE方案(Hyp°thermic Oxygenated Perfusi°n，HOPE)，基于荷蘭OrganAssist系列的ECOPS系統(tǒng)。OrganAssist生產(chǎn)的LiverAssist肝臟灌注系統(tǒng)和體外器官獲取系統(tǒng)見圖3。這項研究證實經(jīng)過機械灌注保存后DCD供體肝臟在肝臟功能、腎臟功能、住院日及術(shù)后并發(fā)癥方面都與DBD供體表現(xiàn)相當。這項研究對于擴大標準供體的應(yīng)用意義重大，雖然還缺乏進一步大樣本的隨機對照臨床試驗，但目前的結(jié)果已足夠讓人興奮[6-7]。

圖3　肝臟灌注系統(tǒng)和體外器官獲取系統(tǒng)Fig.3 Liver perfusi°n system and extra c°rp°ral °rgan pr°curement system

4　常溫機械灌注

常溫機械灌注（N°rm°thermic Machine Perfusi°n, NMP）則是基于模擬正常體溫（37°C）狀態(tài)下進行肝臟灌注保存的方式。在這個條件下肝臟處于與在體環(huán)境類似的代謝狀態(tài)下，肝臟正常生理活動不受中斷，因此可以通過灌注液生化分析評估肝臟功能，是較為理想的保存方式。但這也增加了器官保存失敗的風險，一旦灌注設(shè)備失效，器官將完全暴露于熱缺血狀態(tài)[15-16]。同時，NMP也對灌注液提出了較高的要求：一方面要滿足代謝需求，持續(xù)供給氧氣及能量物質(zhì)，另一方面也要有足夠能力清除代謝廢物。在一些動物實驗中，NMP已被證實對于膽管系統(tǒng)的保護具有明顯優(yōu)勢。在常溫條件下，肝臟可以正常生產(chǎn)膽汁，通過膽汁可以有效預(yù)測肝臟功能[15-16]。OrganOx Metra?常溫肝臟機械灌注系統(tǒng)見圖4。

圖4　常溫肝臟機械灌注系統(tǒng)Fig.4 N°rm°thermic liver perfusi°n system

已經(jīng)有一項基于NMP方案的臨床隨機對照試驗在進行中，F(xiàn)riend P教授帶領(lǐng)的多中心移植團隊計劃招募260名移植患者，隨機分配進入NMP組和SCS組，在這項研究中使用OrganOx機械灌注系統(tǒng)，預(yù)期評估指標包括早期肝臟功能、生存率及術(shù)后血生化指標等，預(yù)計將于2017年結(jié)束[6]（http://www.c°ntr°lledtrials.c°m/ISRCTN39731134）。

5　亞低溫機械灌注

亞低溫機械灌注(Subn°rm°thermic Machine Perfusi°n, SNMP)則是介于低溫與常溫之間的一種灌注方式，環(huán)境溫度設(shè)定于20～30°C。SNMP突出的優(yōu)勢是在對氧氣及能量要求相對較低的條件下評估肝臟功能。目前SNMP的應(yīng)用還限于動物實驗，Selzner1 M教授[17]團隊通過離體豬肝亞低溫機械灌注證實其可以有效保護膽管及膽管上皮細胞，減少保存期損傷。Izamis ML教授團隊則通過對7例廢棄人肝臟進行SNMP保存，最后證實SNMP可以有效保護肝功能、減少細胞損傷，并且在一定程度上有利于肝臟及膽道缺血后的恢復(fù)[19]。

6　機遇與前景

器官短缺一直是世界范圍內(nèi)制約移植發(fā)展的關(guān)鍵問題。近年來擴大標準供體概念的引入使得諸多邊緣供體得到應(yīng)用，同時也帶來了一些新的問題，比如升高了移植失敗的可能，較高的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)病率[21]。機械灌注技術(shù)的引入為邊緣供體的優(yōu)化使用帶來可能[11]。

膽道病變是移植術(shù)后最嚴重的并發(fā)癥之一，被認為是肝移植的“阿克琉斯之踵”。膽道并發(fā)癥發(fā)生的病因很多，器官保存期對于膽道系統(tǒng)上皮細胞再生能力的保護缺乏是其主要原因之一。已有研究表明機械灌注技術(shù)可以對膽管周圍血管叢及膽管周圍腺體進行有效保護，從而保存了膽管細胞的再生能力[22]。P°rte JR教授[23]團隊通過對9對豬DCD供肝模型進行氧合HMP研究，結(jié)果表明氧合HMP可以有效保護膽管周圍血管束，避免小動脈壞死，再灌注后HMP組具有明顯較高的動脈血流。Dutk°wski P[9]則應(yīng)用HOPE方案于大鼠，同樣證實機械灌注可以避免膽道損傷。在Guarrera JV[5]團隊的臨床研究中證實，HMP條件下保存的ECD供體術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)病率明顯低于SCS組。

脂肪肝在邊緣供體中占有很大比例，很多脂肪肝因為擔心術(shù)后移植物丟失而被棄用。van Gulik教授[24]團隊將HMP應(yīng)用于脂肪肝供體中，取得了令人滿意的結(jié)果。機械灌注技術(shù)可以同時引入治療性藥物是其很大的優(yōu)勢。通過在灌注時注入細胞保護物質(zhì)可以很大程度上保護供體穩(wěn)態(tài)。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）被認為具有抗炎及促進再生的作用，機械灌注為間充質(zhì)干細胞在肝臟移植的應(yīng)用提供了一個良好的途徑[6,15]。

灌注液是機械灌注的關(guān)鍵部分。灌注液的組分決定于灌注溫度、灌注時間等因素。傳統(tǒng)的器官保存液，如UW液，HTK液及Celsi°r液都是針對低溫冷凍保存條件設(shè)計的，目前一部分機械灌注方案中應(yīng)用的灌注液都是基于上述液體改良，加入營養(yǎng)物質(zhì)、攜氧物質(zhì)（血液或人造血液）、抗生素、血管活性藥物等。雖然這些灌注液在不同方案下可以對肝臟起到一定保護作用，但目前仍沒有最佳的解決方案[9]。

目前國外尚無大規(guī)模商業(yè)化臨床應(yīng)用的肝臟機械灌注設(shè)備，國內(nèi)也還尚處動物研究階段，這是國內(nèi)器官保存研究的機遇與挑戰(zhàn)。“時間”一直是器官移植手術(shù)中的決定性因素，很多術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生都與血管吻合時間有關(guān)[21]。快速吻合重建一直是外科研究的熱點，近年來磁吻合或無縫線血管重建技術(shù)在血管外科領(lǐng)域已有不錯進展。將磁吻合技術(shù)與器官移植進行巧妙結(jié)合，也是一個值得研究的方向。這不但縮短了血管、膽道吻合時間，也減少了縫線吻合對于血管內(nèi)皮的損傷。通過設(shè)計一種磁吻合機械灌注設(shè)備，將磁環(huán)與供受體側(cè)及灌注設(shè)備進行串聯(lián)，可以最大程度實現(xiàn)快速重建[25]。

個體化治療是臨床醫(yī)學發(fā)展的方向。對于肝臟移植而言，肝臟離體前環(huán)境條件的不同對于保存期的要求也不同。目前臨床肝移植機械灌注爭論的焦點也在于灌注參數(shù)的設(shè)定。不同的灌注方案或許對于不同類型條件下的器官具備保護作用，所以設(shè)計一個多環(huán)境機械灌注設(shè)備是必要的。通過灌注參數(shù)及環(huán)境的調(diào)節(jié)設(shè)計可以最大程度保護供體。

綜上，機械灌注技術(shù)應(yīng)用于臨床肝移植可以進一步擴大供體池，一定程度上解決器官短缺問題。但肝臟機械灌注中幾個關(guān)鍵問題：灌注溫度、灌注時間、灌注壓力、液體流速及灌注液選擇等尚未被圓滿解決，這些也都關(guān)系到器官保存效果及手術(shù)預(yù)后。加快對于機械灌注設(shè)備的研究、優(yōu)化灌注參數(shù)，使機械灌注早日大規(guī)模臨床應(yīng)用，可以為肝臟移植研究帶來新的希望。

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The Application of Machine Perfusion on Clinical Liver Transplantation

【 Writers 】REN Fenggang1,2,3, ZHU Haoyang1,2,3, YAN Xiaopeng1,2,3, LIU Chang1,2,3, ZHANG Xiaogang1,2,3, LV Yi1,2,3
1 Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital, Xi’an Jiaotong University, Xi’an, 710061
2 XJTU Research Institute of Advanced Surgical Technology and Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an, 710061
3 Regenerative Medicine and Surgery Engineering Research Center of Shaanxi Province, Xi’an, 710061

【 Abstract 】Liver transplantation is the only way to treat end-stage liver disease. In order to overcome the shortage of donor, marginal donors have been used widely, which bring about a series of problems. Machine perfusion can stimulate the circulation in vivo and is beneficial for the protection of liver. It could also improve the graft function and reduce postoperative complications, which makes it a hot spot in recent years. The aim of this study is to summarize the current status and prospects of application of machine perfusion on clinical liver transplantation.

liver transplantation, organ preservation, machine perfusion

R657.3

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.06.011

1671-7104(2015)06-0427-05

2015-08-03

西安交通大學第一附屬醫(yī)院長學制醫(yī)學生臨床創(chuàng)新科研基金(15ZD09)

呂毅，教授，博導(dǎo)，E-mail: luyi169@126.c°m