消化系統惡性腫瘤多中心標本庫的建立及管理

【作者】沈思，沈君煒，朱樑，吳超群，李東良，余宏宇，邱媛媛，周薏，姚定康

1 第二軍醫大學附屬長征醫院，上海市，200003

2 復旦大學生命科學學院，上海市，200433

3 南京軍區福州總醫院，福州市，350000

4 上海市中西醫結合醫院，上海市，200082

消化系統惡性腫瘤多中心標本庫的建立及管理

【作者】沈思1，沈君煒1，朱樑1，吳超群2，李東良3，余宏宇1，邱媛媛1，周薏4，姚定康1

1 第二軍醫大學附屬長征醫院，上海市，200003

2 復旦大學生命科學學院，上海市，200433

3 南京軍區福州總醫院，福州市，350000

4 上海市中西醫結合醫院，上海市，200082

為探討建立及管理消化道惡性腫瘤多中心標本庫的有效策略，該文設計了多中心標本庫管理系統并制定標準化操作流程(SOPs)。牽頭全國十家醫院合作收集標本。建庫半年收集消化道惡性腫瘤患者標本共695份。標本臨床資料全面完整，統一編號，分類管理。以標本庫為基礎進行了臨床及分子生物學研究，取得了一定成果，為多地區、多種類消化系統惡性腫瘤的研究提供了平臺。

消化系統惡性腫瘤；多中心；標本庫

0　引言

消化系統惡性腫瘤占全世界惡性腫瘤的50%以上，是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。其中以胃癌、大腸癌、肝癌為最常見。胃癌在全世界癌癥相關疾病的病因中排名第三，雖然近年來發病率有所下降，但患者的結局仍令人擔憂[2]。我國結直腸癌的年發病率正以4.2%的年增長率飆升，逐漸接近歐美發達國家水平[3]。肝癌在全世界最常見的癌癥中排名第五，每年的發病人數與死亡人數幾乎相等，是惡性腫瘤導致死亡的主要病因[4]。因此對消化道惡性腫瘤的早期診斷及治療的研究迫在眉睫。Bryant J等[5]對門診224名腫瘤患者進行調查發現，84%的患者愿意將腫瘤組織捐贈給生物標本庫，其中92%同意將標本冷凍保存以供實驗。Caixeir° NJ等[6]對95名衛生從業人員進行調查發現，56%的從業者支持組建腫瘤標本庫并自愿參加標本募捐工作，其中85%對標本庫在未來癌癥診斷及治療研究中的重要性深表贊同。隨著基因芯片技術、蛋白質譜技術、二代測序技術等新技術的發展，越來越多的腫瘤標記物被發現并應用于腫瘤早期診斷。因此構建一個以消化系惡性腫瘤標本為基礎的研究平臺，建立大數據綜合性標本庫對臨床研究、靶向藥物開發、分子生物學研究及統計學分析都有著重大意義。本文將探討如何建立消化系統惡性腫瘤多中心標本庫，并進行信息化管理。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1標本來源

本標本庫為多中心標本庫，以上海長征醫院為主中心，以上海長海醫院、上海市中西醫結合醫院、上海東方醫院、上海市閘北區中心醫院、上海市普陀區利群醫院、南京軍區福州總醫院、解放軍總院第一附屬醫院、解放軍第八十九醫院、南昌大學附屬新余市人民醫院為分中心，各醫院同時開展標本的采集和整理工作，并最終匯總至主中心進行保存，以備試驗。本標本庫中的血標本、尿標本、糞標本取自住院病人及健康體檢的正常人，組織標本取自外科手術后病理學診斷明確的癌組織、癌旁組織和同例臨近部位的正常組織。

1.1.2主要設備與試劑

主中心與各分中心采用的主要設備型號相同，試劑來源一致：海爾-80℃深低溫冰箱（DW-86L626）；液氮儲存罐（CBS）；標本運輸箱（FYL-BW-11L）；高速臺式冷凍型離心機(1730R)；高速離心機（F-33D-110V）；紫外分光光度儀(Therm° Scientific Nan°Dr°p 2000)；光學顯微鏡(Olympus SZX7—1013)；制冰機（AF100AS)；超凈臺（SW-CJ-1FDA）；Triz°l試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒等均購自TAKARA公司；DEPC水購自上海威奧生物技術有限公司；氯仿、異丙醇購自南通普艾特化工有限公司。

1.1.3患者知情同意書

留取標本前均經過健康體檢志愿者、患者本人或家屬同意，并簽署知情同意書。在不損害標本提供者利益和隱私的前提下進行標本的收集工作。本標本庫的全部標本及標本提供者的臨床資料均只用于醫學科研，并保證合理合法。

1.2方法

1.2.1標本庫專業人員的培訓

標本庫的管理方式是在統一病例入選標準、標本的收集和處理程序的前提下，主中心總體控制，各分中心各自管理。每個分中心委派具體負責人，管理日常標本收集整理、臨床資料登記、數據上傳至主中心等具體事務。參與者包括各醫院消化科、普外科等本課題組內人員，每個分中心5～10人，均為臨床醫學本科以上學歷，并進行了標本收集及臨床資料收集隨訪等相關業務的培訓，在專業技術人員的指導下通過上崗考核后方可納入[7]。

1.2.2數據庫的建立與信息化管理

標本信息化管理采用我課題組自行設計的數據管理軟件，以Wind°ws XP為系統運行平臺，輸入賬號、密碼可登陸系統，完成數據的導入、導出、查詢及簡單的統計分析。根據課題組情況，該軟件設置了3種登記表：標本信息登記表、標本出庫登記表、標本運輸登記表。軟件具有上傳圖片功能，可將影像學檢查電子圖像、輔助檢查化驗單照片、手術大體標本及病檢轉移淋巴結的照片通過互聯網在軟件平臺實時發送給主中心。各分中心之間無法共享數據，不同級別的用戶只能在自己的使用權限下進行操作。通過對659份標本信息的錄入和上傳，驗證了該軟件擁有完善的數據錄入、查詢界面，這種簡單便捷的管理手段可操作性較強，有效提高了標本信息管理的準確性。

標本庫標本的留取、處理、存放、出庫、入庫等由專人負責管理。①標本入庫前需填寫標本信息登記表，其內容包括：標本提供者性別、年齡、標本來源（手術室、住院部、門診、體檢中心等），如為住院病人需登記住院號、床號；臨床診斷；輔助檢查結果；標本類型（正常、癌、癌旁、腺瘤、息肉等）；標本性質（原發、復發、轉移等）；腫瘤標本分期；分化程度；治療過程；標本種類（血、尿、糞、組織）；采集時間（標本離體時間）；低溫時間（放入深低溫冰箱保存時間）；標本編號；位置登記號；流水號；手術醫生；采集員；記錄員。②標本資源必須用于課題組的相關研究，物盡其用，減少不必要的浪費。使用者應為課題組成員，需嚴格遵守管理規范，提交申請書，寫明需要的標本類別，數量，研究方法等，由管理員和主中心負責人簽字同意方可取出，申請書由主中心負責人統一保管，并且在出庫登記表中登記對應編號的標本的出庫日期，出庫數量，使用者。標本出庫時盡量減少冰箱打開的時間及次數，防止標本凍融，已出庫的標本不得重復入庫使用。

1.2.3血標本的留取

住院患者要求盡量3 d內清淡飲食，盡量空腹采血，一般在晨起早餐前采血。抽取全血5 mL，顛倒混勻，為防止溶血，置于5 mL EDTA-K2真空抗凝采血管內保存；血樣抽取后盡快送至實驗室，若不能及時送出需將其儲存于4°C冰箱，且時間絕不能超過2 h[8]。以3 000 r/min轉速離心10 min[9]，離心后檢查全血分為三層，上層淡黃色液體為血漿，中層為富含血小板的白膜層，下層為紅細胞；檢查無溶血后，小心吸取上層血漿，避免污染；吸取血漿分裝至1.5 mL eppend°rf管內，每管200 mL；每5 mL血液可留取6～8管，并在管蓋和管壁標記標本登記號。將分離出的血漿盡快保存[10]。

1.2.4尿標本的留取

保證所有標本提供者在樣品采集之前1周未服用抗生素藥物，留取晨起清潔中段尿。尿液用一次性帶蓋尿液試管采集，上有標本登記號，收集尿液量約30～50 mL，對于尿量的收集，原則是越多越好，以便于下一步提取足量的RNA，目前我們采用50 mL離心管取尿液，將裝好尿液的離心管放入干燥、清潔的有蓋容器內帶到醫院，注意此過程不需冷藏運輸，盡快保存。

1.2.5糞標本的留取

(1) 清腸導瀉收集法

醫生可在腸鏡檢查者預約腸鏡時發放帶蓋常規大便標本盒，患者在腸鏡檢查當天口服瀉藥后腹瀉，囑患者收集腹瀉腸液10～15 mL，放入干燥、清潔、無吸水性的50 mL糞便盒或15 mL離心管帶到醫院，盒上有標本登記號，盡快保存。

(2) 常規糞便收集法

所有標本提供者在樣品采集之前1周未服用抗生素藥物，糞便留取前一天盡可能素食，糞便用一次性帶蓋糞便盒采集，盒上有標本登記號，留取自然排泄糞便，收集糞便量約10g(約拇指頭大小)，放入干燥、清潔、無吸水性的50 mL糞便盒內帶到醫院，盡快保存。

1.2.6組織標本的留取

在腫瘤離體1 h內留取組織[11]，分別取癌組織，癌旁組織（距癌腫邊緣2 cm至5 cm范圍內），正常組織（距癌腫邊緣5 cm以上范圍內）[12]。手法如下：用止血鉗夾取至腸壁黏膜或黏膜下層（注意：組織不宜夾取過多，不可取到肌層），以手術刀片或剪刀快速切取0.5 mm×0.5 mm（黃豆粒大小）組織塊，標本上附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應盡量剝去或切除，以利正確留取組織。將組織塊分別放于相對應的凍存管中，標本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液對標本的滲入。留取的過程中需注意，任何固定液對人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。眾多研究發現為減少熱缺血時間，組織標本從離體到凍存不得超過30 min[12-15]。將有標本登記號的凍存管按照存放標準放置保存。

1.2.7標本的運輸

多中心標本的運輸分為同城標本運輸和異地標本運輸。同城標本由專人用裝有冰塊或冰袋的標本運輸箱在規定時間內將其送至實驗室，填寫標本入庫登記表，技術人員將標本處理后保存于-80°C冰箱。異地標本采用冷鏈運輸方式，負責人聯系冷鏈物流公司，確認標本運輸儲存溫度，目前國內冷機制冷可達最低溫度為-22°C。計劃每批次標本的數量，選擇合適的包裝耗材。各異地分中心在啟動前，出具相關證明文件給物流公司，在各地機場提前備案。物流公司提供整個項目的運輸計劃書，課題組開會通過后簽訂相關運輸合同。標本在分中心收集好后，由專人負責郵寄并填寫標本運輸登記表，寫明標本數量、運輸時間、包裝方式、快遞單號，以便主中心負責人跟蹤郵件，監督運輸造成的標本質量問題并記錄反饋[16]。

2　結果

2.1建立規范化的標本收集流程

建立標本庫前期，課題組成員開會研究，制定了標準化操作流程SOPs（Standard Operati°n Pr°cedures），包括標本收集、處理、運輸、保存和信息反饋等相關技術的建立，如圖1。經過主中心及兩個分中心兩周內近30例標本的試運行驗證，確定了該方案的可行性，并修改完善了各項技術，強調了收集標本中易犯錯誤及需注意的細節，使標本收集工作更加標準化、規范化。

圖1　規范化標本庫建設流程圖Fig.1 Fl°w chart °f standardized specimen library c°nstructi°n

2.2標本收集情況

本標本庫自2015年3月開始收集標本的工作，建庫半年收集了消化道惡性腫瘤患者的標本695份，其中組織標本199份，血漿標本259份，尿液標本132份，糞便標本105份。同一患者收取的標本種類根據臨床工作的具體情況而定，而非四種標本全部收取。標本提供者中胃癌患者125例，肝癌患者6例，健康體檢志愿者37例，大腸癌患者150例，其中早癌組5例，晚癌組145例，由于部分大腸息肉有惡變傾向，甚至與早癌界限不清，我們還收集了79例大腸息肉患者的標本。

2.3標本質量監控

在收集標本的過程中，不斷總結經驗，每半年完成階段性記錄，對所取標本的質量進行檢驗和記錄，并根據檢驗結果對標本留取、運輸、處理和儲存的方法及條件給予合理調整。2015年9月末，課題組隨機抽取6份標本，進行總RNA鑒定，紫外分光光度計讀取OD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間，說明所得RNA濃度較高。1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2，第1列為RNA marker，2～7列為標本RNA，第8列為空白對照，每個標本均有三個RNA 條帶，從上到下分別是28S，18S以及5S。表明RNA保存比較完整，能夠滿足后續試驗要求[17]。

圖2　6例總RNA標本的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agar°se gel electr°ph°resis °f 6 cases °f t°tal RNA was analyzed

2.4本標本庫的優勢及創新點

根據收集的標本數據，經統計分析得到如下結果：胃癌患者中男性患者77例，約占61.6%，女性患者48例，約占38.4%，男性明顯高于女性。大腸癌及大腸息肉患者中對比各組患者性別統計數據發現，三組患者女性人數均略高于男性，如圖3。胃癌患者年齡分布如圖4，可見胃癌患者年齡在51歲～60歲區間人數最多，大腸癌患者年齡分布如圖5，可見大腸癌患者年齡在61～70歲區間人數最多。以上結果均具有統計學意義。

本標本庫的優勢為：①標本庫為多中心標本庫，可以在短時間內或試驗進行的同時迅速收集大量標本，提高了研究的效率，達到事半功倍的效果。而且標本來源廣，避免了在同一家醫院或同一地區的醫院收集標本所造成的局限性，使研究結果具有更廣泛的意義，可信度較大；②標本取自全國不同的省市，具有地域性的特點，可單獨研究某一地區的腫瘤患者的發病、診治及預后的情況；③全部標本除記錄標本位置登記號，流水號外，還對應登記國際疾病分類標準編碼[ICD-10]，與國際接軌，便于同國外標本庫進行合作研究[18]；④本標本庫正在逐漸開展家族遺傳病例的收集，目前已收集家族遺傳性結腸息肉的組織及血液標本，共8例，標本全部為來自同一家族的患者，且均為直系親屬。

圖3　大腸癌及息肉患者性別分布Fig.3 Sex distributi°n in patients with c°l°n cancer and p°lyps

圖4　胃癌患者年齡分布Fig.4 Age distributi°n °f gastric cancer patients

圖5　大腸癌患者年齡分布Fig.5 Age distributi°n °f c°l°n cancer patients

3　討論

近年來，隨著基因芯片技術、蛋白質譜技術、二代測序技術等新技術的發展，臨床試驗和分子生物學試驗都進入了大數據時代，研究對象從動物和細胞株逐漸轉向人體本身，對惡性腫瘤的研究也逐漸從臨床研究進展到對腫瘤相關基因和蛋白質結構及功能的探索，因此國際上正規的惡性腫瘤的標本庫相繼涌現，美國組織庫協會AATB(American Ass°ciati°n °f Tissue Banks)于1984年制定了第一部組織標本庫的權威性標準[19]；1987年，美國國立衛生院建立人類組織協作網CHTN(C°°perative Human Tissue Netw°rk)，收集組織標本20萬份以上[20]；1993年，美國MD Anders°n癌癥中心建立世界上最早的專業腫瘤標本庫[21,22]；同年歐洲組織庫協會EATB(Eur°pean Ass°ciati°n °f Tissue Banks)成立，并制定EATB標準[23]；2003年，英國建立國家腫瘤組織庫[24]；同年，歐洲癌癥機構組織OECI(Organizati°n °f Eur°pean Cancer Institutes)建立歐洲人類冰凍腫瘤組織標本庫Tubafr°st(Eur°pean Human Tum°r Fr°zen Tissue Bank)[25]。近年來，我國多家醫療機構也建立了腫瘤標本庫，其中河南腫瘤醫院與天津醫科大學腫瘤醫院分別與挪威和美國合作，使我國腫瘤標本庫的建設逐漸標準化、國際化。

我課題組吸收學習了國內外先進的建庫及管理技術并根據課題組實際情況設計了信息化自主管理系統，與全國十家醫院合作構建消化系統惡性腫瘤標本庫，合作對象中，八家為三甲醫院，技術力量雄厚，醫療服務覆蓋中國東部及北部大部分地區，有能力提供數量多、質量高的標本，是標本庫順利開展的有力保障。標本庫自建庫以來收集標本共695份，臨床資料完整。留取標本前均經過健康體檢志愿者、患者本人或家屬同意，并簽署知情同意書。標本的留取、運輸、處理、保存都由專人負責，所有人員均經過專業技術培訓并通過任職上崗考核，責任明確，便于管理。課題組核心成員開會討論制定標準化操作流程SOPs，并分發各分中心負責人。標本出庫、入庫以及登記表的填寫由負責人監督完成。各分中心均配備-80℃深低溫冰箱，收取的標本暫時存放于此，完成一階段收集工作后由專人統一經過冷鏈運輸郵寄至上海長征醫院主中心。同時將患者和健康體檢者的臨床信息通過數據管理軟件傳送給主中心負責人。每半年隨機抽取5～10例標本進行提取RNA鑒定標本質量，并結合標本應用于科研實驗的情況進行分析，發現影響標本質量的原因，不斷反饋，修正標本收取流程中各環節的問題[26]。

目前，標本庫的建立和管理雖然處在初級階段，但運行順利，各項程序基本步入正軌，所收標本已應用于課題組的科研工作，并取得了一定成果。下一步工作重點是擴大標本庫，今年9月開始開展肝癌標本的收集工作，并將食管癌、膽囊癌、胰腺癌等列入標本庫收集對象。我課題組將不斷努力，充分保護，合理利用標本，將臨床與基礎相結合，實現信息和資源共享，為科研提供平臺，早日攻克消化系統惡性腫瘤這一難題。

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Establishment and Management of Multicentral Collection Biosample Banks of Malignant Tumors from Digestive System

【 Writers 】SHEN Si1, SHEN Junwei1, ZHU Liang1, WU Chaoqun2, LI Dongliang3, YU Hongyu1, QIU Yuanyuan4, ZHOU Yi1,
YAO Dingkang1
1 Chang Zheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University, Shanghai, 200003
2 School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai, 200433
3 Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou, 350000
4 Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine of Shanghai, Shanghai, 200082

【 Abstract 】To establish and manage of multicentral collection bio-sample banks of malignant tumors from digestive system, the paper designed a multicentral management system, established the standard operation procedures (SOPs) and leaded ten hospitals nationwide to collect tumor samples. The biobank has been established for half a year, and has collected 695 samples from patients with digestive system malignant tumor. The clinical data is full and complete, labeled in a unified way and classified to be managed. The clinical and molecular biology researches were based on the biobank, and obtained achievements. The biobank provides a research platform for malignant tumor of digestive system from different regions and of different types.

the digestive system malignant tumor, multicenter, biobank

R735

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.06.006

1671-7104(2015)06-0410-05

2015-10-08

上海市科委科技支撐項目（12142200900）；國家自然科學基金資助項目（11472300）

沈思，E-mail: 896821168@qq.c°m

朱樑，教授，主任醫師，E-mail: zhuliangcz@126.c°m