肺復康對Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及E-cadherin、Vimentin和TGF-β表達的影響

夏 丹，李勇敏，譚小寧，匡 朝，郭建生*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙410208；2.湖南省教育廳中藥現代化研究重點實驗室，湖南 長沙410208；3.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙410006）

肺癌是發病率、 死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，嚴重威脅人類健康和生命。 手術、放療、化療是目前治療肺癌的主要手段，但易復發轉移，而中醫藥療法在防治肺癌復發轉移方面具有獨特的優勢。 肺復康為湖南省中醫藥研究院附屬醫院制劑，具有益氣養陰、化瘀解毒的功效，臨床上已取得了較好的療效， 但對其具體的作用機制尚無深入研究。 本研究擬建立小鼠Lewis 肺癌移植瘤模型， 探討肺復康抗肺癌生長及轉移的分子機制，為其治療肺癌及防治肺癌轉移的臨床運用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物與瘤株

SPF 級C57BL/6 小鼠48 只， 體質量18～22 g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（湘）2011-0003。 小鼠Lewis 肺癌細胞株，由中南大學湘雅細胞中心提供。

1.2 藥物

肺復康方由白參10 g，黃芪10 g，沙參10 g，麥冬10 g，生地黃10 g，女貞子10 g，靈芝10 g，夏枯草15 g，莪術9 g，白花蛇舌草20 g，重樓10 g，甘草5 g 組成。生藥煎煮后，濃縮，70%乙醇提純，得干浸膏，備用，1 g 浸膏相當于3.58 g 生藥（由湖南省中醫藥研究院附屬醫院提供）。 5-氟尿嘧啶 （5-Fu）， 由上海旭東海普藥業有限公司提供， 批號FA120701。

1.3 試劑

RIPA 裂解液（北京普利萊基因技術有限公司）；Tris（美國Sigma）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國Sigma）；Super ECL Plus 超敏發光液（Thermo pierce）；兔抗E-cadherin 單克隆抗體（ab133597）、兔抗Vimentin 多克隆抗體（BS1855）、兔抗TGF-β 多克隆抗 體 （Ab66043）、 小 鼠 抗β-actin 單 克 隆 抗 體（60008-1-Ig）、 羊抗兔IgG-HPR、 羊抗小鼠IgGHPR，均由Proteintech 公司提供。

1.4 儀器

DY89-1-電動玻璃勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DYY-6C-電泳儀、DYCZ-24EN-電泳槽、DYCZ-40A-轉膜儀， 均由北京六一儀器廠提供。

2 方法

2.1 小鼠Lewis 肺癌移植瘤的建立

參照文獻[2-3]方法，將液氮凍存的小鼠Lewis 肺癌細胞懸液復蘇后，搖勻，接種至8 只C57BL/6 小鼠（雌雄各半）右側腋窩皮下傳代，每只0.2 mL。 3周后，將荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，無菌剝離瘤體，取其中生長良好、無破潰的腫瘤組織，用生理鹽水沖洗后剪碎，勻漿，過200 目篩制成小鼠Lewis 肺癌無菌單細胞懸液， 用生理鹽水調整細胞濃度至1.7×107/mL。將上述細胞懸液迅速接種至30 只小鼠右側腋窩皮下，0.2 mL/只。

2.2 分組及給藥

小鼠接種后隨機分為3 組：肺復康組、5-Fu 組、模型組， 每組10 只， 雌雄各半。 另取同批健康C57BL/6 小鼠10 只（雌雄各半）作為正常組。接種后24 h 開始給藥。 肺復康組小鼠灌胃17.2 g 生藥/kg，給藥體積為20 mL/(kg·d)，連續15 d。 5-Fu 組小鼠腹腔注射5-Fu 25 mg/kg，給藥體積為10 mL/kg，隔天1 次，共給3 次。 模型組及正常組小鼠灌胃與肺復康組等體積的蒸餾水，連續15 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 腫瘤體積及抑瘤率測定 自皮下可觸及腫瘤時開始， 每3 天用游標卡尺測量腫瘤長徑a 及垂直短徑b，按公式V=（1/2）ab2計算腫瘤體積。末次給藥后24 h 頸椎脫臼處死小鼠，在無菌操作下，完整剝離腫瘤瘤體并立即稱量瘤質量，計算抑瘤率。 抑瘤率=（1-治療組平均瘤質量/對照組平均瘤質量）×100%。

稱重后立即取適量腫瘤組織，并取適量癌旁組織，正常組在與其他組小鼠腫瘤生長部位相應部位取一小塊肌肉組織。 將組織分裝后用-70 ℃液氮凍存備用。

2.3.2 Western-Blot 檢 測E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 的蛋白表達 剪取0.25 g 的腫瘤組織塊，加入RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度， 上樣后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜，封閉，一抗（兔抗Ecadherin 單克隆抗體、兔抗Vimentin 多克隆抗體，稀釋比例1∶500；兔抗TGF-β 多克隆抗體，稀釋比例1∶1 000；小鼠抗β-actin 單克隆抗體，稀釋比例1∶5 000）孵育，TBS-T 緩沖液洗滌15 min×3 次，二抗（羊抗兔IgG-HPR、羊抗小鼠IgG-HPR，稀釋比例1∶3 000） 孵育，TBS-T 緩沖液洗滌15 min×3 次，ECL法顯影，將曝光后的底片掃描。 以β-Actin 為內參，測E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 的蛋白表達，相對表達量為各蛋白與β-Actin 顯影條帶灰度值的比值。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 小鼠死亡情況

肺復康組于接種后第4 天死亡1 只，解剖發現腫瘤向心生長壓迫胸腔，考慮死亡原因為心肺功能衰竭。

3.2 各組腫瘤體積、瘤質量的比較

隨著時間的推移， 各組小鼠腫瘤體積越來越大。 5-Fu 組、肺復康組小鼠腫瘤體積與模型組相比減小，差異有統計學意義（P＜0.01）。 見表1。

5-Fu 組、肺復康組小鼠瘤質量與模型組相比降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；5-Fu 組、肺復康組抑瘤率分別為40%、36%。 見表2。

表1 接種后不同時間點各組腫瘤體積比較（±s，cm2）

表1 接種后不同時間點各組腫瘤體積比較（±s，cm2）

注：與模型組比較▲▲P＜0.01。 下表同。

組 別模型組肺復康組5-Fu 組n 10 9 10第7 天0.59±0.07 0.35±0.05▲▲0.37±0.05▲▲第10 天1.667±0.16 0.975±0.16▲▲0.915±0.15▲▲第13 天2.40±0.31 1.42±0.27▲▲1.44±0.28▲▲第16 天2.87±0.30 2.29±0.30▲▲2.11±0.28▲▲

表2 各組腫瘤質量、抑瘤率的比較 （±s）

表2 各組腫瘤質量、抑瘤率的比較 （±s）

末次瘤質量(g)2.26±0.27 1.45±0.24▲▲1.36±0.23▲▲組 別模型組肺復康組5-Fu 組n 10 9 10抑瘤率(%)—36 40

3.3 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β表達的比較

與正常組相比，模型組癌及癌旁組織中E-cadherin 的表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01），而Vimentin、TGF-β 的表達升高， 差異有統計學意義（P＜0.01），造模成功。 見圖1、表3。 與模型組癌組織相比，5-Fu 組和肺復康組癌組織中E-cadherin 的表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組癌旁組織相比，5-Fu 組和肺復康組癌旁組織中Ecadherin 的表達水平升高， 差異有統計學意義 （P＜0.01）。 見圖1、表4。

E-cadherin 在模型組癌組織的表達水平顯著低于癌旁組織（P＜0.05）。 見圖1、表4。

圖1 小鼠癌、癌旁組織中E-cadherin、Vimentin 和TGF-β的蛋白水平電泳圖

表3 模型組與正常組E-cadherin、Vimentin和TGF-β 表達的比較 （±s，n=4）

表3 模型組與正常組E-cadherin、Vimentin和TGF-β 表達的比較 （±s，n=4）

注：與正常組比較**P＜0.01。

組 別正常組模型組組織類型—癌組織癌旁組織E-cadherin 0.45±0.02 0.30±0.03**0.33±0.02**Vimentin 0.13±0.02 0.32±0.03**0.31±0.02**TGF-β 0.31±0.02 0.56±0.02**0.56±0.02**

4 討論

中醫認為肺癌發病多是在正氣虛損的基礎上，毒、熱外邪侵襲，或痰瘀內生而致，因而益氣養陰、清熱解毒、活血化瘀、化痰軟堅合用是中醫治療肺癌及防治肺癌轉移的常用大法。 肺復康由白參、麥冬、生地黃、夏枯草、莪術、白花蛇舌草等12 味中藥組成，具有益氣養陰、化瘀解毒之功效，臨床上取得了較好的療效。 由于中藥毒副作用小[4]，適用于癌癥患者的服用， 因此肺復康的實驗研究具有現實意義。

本實驗中，各組接種小鼠均成瘤，表明Lewis 肺癌移植瘤模型建立成功。 通過對小鼠腫瘤體積、腫瘤質量的測定， 結果顯示肺復康可減小腫瘤體積，降低腫瘤質量，減慢腫瘤的生長速度，說明肺復康對Lewis 肺癌小鼠腫瘤的生長具有一定的抑制作用。

表4 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 表達的比較 （±s，n=4）

表4 各組癌、癌旁組織E-cadherin、Vimentin 和TGF-β 表達的比較 （±s，n=4）

注：與模型組癌組織比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組癌旁組織比較**P＜0.01。

組 別模型組肺復康組5-Fu 組E-cadherin 0.30±0.03 0.58±0.02▲▲0.60±0.03▲▲Vimentin 0.32±0.03 0.32±0.03 0.32±0.02 TGF-β 0.56±0.02 0.55±0.02 0.55±0.02 E-cadherin 0.33±0.02▲0.59±0.03**0.60±0.02**Vimentin 0.31±0.02 0.31±0.03 0.30±0.02 TGF-β 0.56±0.02 0.57±0.03 0.57±0.03癌組織癌旁組織

上皮-間質轉化（EMT）是指細胞從上皮表型向間質表型轉變，可使腫瘤細胞表型改變，從而使其獲得較強的侵襲和轉移的能力[5]。 研究表明，上皮標志因子E-cadherin 是一種抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的黏附因子，其表達的降低導致同源細胞間粘附力下降，易使腫瘤細胞侵襲性生長，脫離原發部位向遠處轉移[6-7]。 Vimentin 為間質細胞標志因子，其表達的增高標志著EMT 過程的發生。Zhu 等通過體外實驗，發現Vimentin 具有維持、促進腫瘤細胞的間質轉化及侵襲的作用[8]。在腫瘤發展的早期，TGFβ 是主要的腫瘤抑制因子； 而在腫瘤發展的晚期，TGF-β 表達增強， 高水平的TGF-β 可通過誘導EMT 的發生促進腫瘤的侵襲和轉移性傳播，從而促進腫瘤的進展[9-10]。

本研究發現， 模型組癌及癌旁組織中E-cadherin 的表達較正常組降低(P＜0.01)；肺復康組癌、癌旁組織中E-cadherin 的表達較模型組癌、癌旁組織升高(P＜0.01)，提示肺復康可能通過上調E-cadherin的表達，從而促進腫瘤細胞間的同質粘附而抑制腫瘤的轉移。 與正常組相比，模型組癌及癌旁組織中Vimentin、TGF-β 的表達升高(P＜0.01)；而與模型組癌及癌旁組織相比，Vimentin、TGF-β 的表達無論是肺復康，還是5-Fu，都無明顯差異（P＞0.05），表明肺復康、5-Fu 對Vimentin、TGF-β 的表達可能沒有影響。

據報道， 肺癌組織中E-cadherin 的表達水平明顯低于癌旁組織，而Vimentin、TGF-β 的表達水平明顯高于癌旁組織[11-12]。本實驗結果顯示，除Ecadherin 在模型組癌組織的表達水平低于癌旁組織（P＜0.05）外；各組E-cadherin、Vimentin、TGF-β 的表達水平，癌組織與癌旁組織相比均無顯著性差異（P＞0.05）。其原因可能是本實驗取材部位不當，距癌組織一定距離處根據肉眼觀察認為該部分組織為良性組織而將其單獨切取，所取的可能并非癌旁組織。 關于癌旁組織的取材部位，有關文獻報道癌旁組織離癌組織的距離各不相同[11，13]，且均為臨床患者肺癌切除標本，難以作為小鼠癌旁組織取材的標準。 我們認為癌旁組織是與癌變有密切關系的、伴有良性病變或癌前病變的組織，與癌有組織學上的過渡，位于癌組織和正常組織之間，沒有具體的范圍，可大可小。 故其取材應該是先將癌組織連同可能為“癌旁組織”的組織一起切出，再用切片機自癌組織一端連續切片并在光鏡下觀察每張切片的病理形態學特征，當某張切片的病理形態明顯不同于前一張時， 即找到了癌組織與癌旁組織的分界處，此張切片即可作為癌旁組織。

綜上所述， 肺復康對Lewis 肺癌小鼠腫瘤的生長具有一定的抑制作用，其機制可能與上調E-cadherin 的表達，從而增加腫瘤細胞間的黏附能力而抑制腫瘤的侵襲、轉移有關。 Vimentin、TGF-β 在肺復康抗肺癌轉移中的作用，以及C57BL/6 小鼠癌旁組織的取材部位和方法還有待進一步研究。

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