益氣活血湯對急性心肌梗死模型大鼠Ras、ERKl、p-ERKl和C-Raf-1表達的影響

郭 樂，潘 坤，尹 勝，楊軍輝*

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

心肌缺血是由于心臟的血液灌注減少，從而影響心臟的供氧， 缺氧狀態下心肌能量代謝異常，導致無法支持心臟正常工作的一種病理狀態。 近年來一些學者提出了“治療性血管新生”的新途徑，也就是通過某些藥物的干預，增加冠狀動脈分支或側枝循環，從而達到恢復缺血心肌血供，改善患者癥狀和預后的目的， 但是目前這種設想僅處在研究階段， 因此通過治療性血管新生減輕心肌缺血損傷，逐漸成為目前研究的熱點[1]。 而越來越多的證據表明，中藥可從降低心肌耗氧、清除氧自由基、抑制鈣超載、抑制細胞凋亡、促血管生成等不同途徑起到抗心肌缺血的作用[2]，因此中醫藥在“治療性血管新生”的新途徑方面表現出了臨床優勢。 我們的實驗通過觀察益氣活血湯對大鼠缺血心肌在Ras/Raf/MEK/ERK 信號級聯通路中重要分子的影響， 探討中醫藥的益氣活血促血管生成作用。 現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康Wister 大鼠64 只，雄性，體質量為270～290 g， 由湖南中醫藥大學動物房提供，實驗動物許可證號：SCXK(湘2009-0012)，購自長沙市天勤生物技術有限公司。

1.1.2 藥物與試劑 益氣活血湯處方組成： 黨參20 g，黃芪30 g，丹參20 g。藥物購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，經水煎2 次過濾，合并煎液，濃縮至含生藥2 g/mL，冰箱貯存備用。倍他樂克(metoprolol)，由阿斯利康制藥有限公司生產，批號為1308102。C-Raf-1 兔源性單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供；Ras、p-ERKl 兔源性單克隆抗體由北京博奧森生物技術有限公司；ERK1 兔源性單克隆抗體由中杉金橋工程有限公司提供。

1.1.3 主要儀器 XD-7100 型動物心電圖機，上海醫療器械高技術公司；KD2258 輪轉式石蠟切片機，金華益迪醫療設備公司；BX43 研究型顯微鏡，奧林巴斯集團；TP-8 組織攤片機， 久圣醫療設備有限公司；MIAS 醫學圖像分析管理系統，麥克奧迪實業集團有線公司。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 按文獻[3]的方法進行造模。 大鼠麻醉后固定，氣管插管，連接人工動物呼吸機支持呼吸， 從胸骨左側第3、4 肋間正中線旁開5 mm 行縱向切口， 于心臟左心耳根部下方2～3 mm 處穿線，結扎冠狀動脈左前降支，建立心肌缺血模型。 結扎后迅速將心臟還納，關閉胸腔，恢復自主呼吸。 手術前后連接動物心電圖機，記錄心電圖，以術后Ⅱ導聯心電圖ST 段弓背向上抬高為造模成功的標志。 術后連續3 d 注射青霉素80 萬U／d 以預防感染。 假手術組僅開胸穿線，不做其他處理，其余操作同上。

1.2.2 分組及給藥 實驗分為6 組，其中空白對照組、假手術組各5 只，模型組、益氣活血湯大劑量組（下稱大劑量組）、益氣活血湯小劑量組（下稱小劑量組）、倍他樂克組于造模后隨機分組，造模54 只，存活32 只，各組8 只。 用藥各組依據動物體質量參照動物與人體體表面積折算的等效劑量，大劑量組益氣活血湯用藥量為12.6 g/(kg·d)， 小劑量組益氣活血湯用藥量為6.3 g/(kg·d)，加蒸餾水按相同的灌胃體積配制各濃度藥液，每日灌胃1 次；空白對照組、 模型組與假手術組大鼠均給予等體積蒸餾水，每日灌胃1 次；倍他樂克組按10 mg/(kg·d)確定給藥量，每日灌胃1 次。 均造模后24 h 開始灌胃，持續12 d。

1.2.3 指標檢測 免疫組化方法：以上各組大鼠于灌胃12 d 后隨機取5 只進行腹腔麻醉， 迅速剪開胸腹腔，迅速摘取心臟，將缺血區心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，4%多聚甲醛固定，固定24 h 后組織脫水、透明、浸蠟、包埋，制備厚5 μm 組織切片，石蠟切片，常規脫蠟至水；3%雙氧水滅活，PBS洗3 min，共3 次，抗原修復，PBS 洗3 min，共3 次，滴加封閉液，室溫（37 ℃）孵育20 min，傾去，勿洗；滴加1∶100 稀釋的一抗，37 ℃孵育2～3 h，PBS 洗3 min， 共3 次， 滴加生物素化二抗工作液， 室溫（37 ℃）孵育20 min，PBS 洗3 min，共3 次，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，室溫（37 ℃）孵育20 min，PBS 洗3 min， 共3 次，DAB 顯色， 自來水洗，蘇木素復染，脫水，透明中性樹膠封片。

顯微鏡下見細胞漿或細胞核有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽性表達，每張切片觀察5個視野，400倍鏡下觀察照像， 以MIAS 醫學圖像分析系統測定其光密度值，進行定量分析。

1.3 統計學分析

所有數據經SPSS 16.0 軟件進行統計學處理。 所有計量資料以“±s”表示，均數間經方差齊性檢驗后， 進行單因素方差分析， 多重比較采用LSD 和Dunnet 檢驗， 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

益氣活血湯對缺血心肌大鼠Ras、ERK1、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達的影響：

ERK1 蛋白、p-ERK1 蛋白、C-Raf-1 蛋白、Ras蛋白均表現為棕黃色反應產物沉積即為陽性著色，ERK1 蛋白主要表達于心肌細胞胞漿內，p-ERK1 蛋白、C-Raf-1 蛋白、RAS 蛋白在心肌細胞核及細胞質內均有表達。 結果顯示空白對照組與假手術組心肌細胞染色較淺，呈淡黃色；模型組心肌細胞內呈棕黃色；大、小劑量及倍他樂克組心肌細胞染色呈深棕黃色，較模型組顏色深。 見封三彩圖圖1。

各項指標空白組與假手術組間差異均無統計學意義(P＞0.05)，模型組高于空白組、假手術組，差異有統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)。 Ras、C-Raf-1 蛋白表達：小劑量組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；大劑量組及倍他樂克組與模型組比較均有增高，且高于小劑量組，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)；但大劑量組與倍他樂克組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。 ERK1、p-ERK1 蛋白表達：大、小劑量及倍他樂克組與模型組比較均有增高，差異有統計學意義(P＜0.05 或P＜0.01)；大劑量組較小劑量組增多更明顯(P＜0.05)。 倍他樂克組與大劑量組、小劑量組比較差異無統計學意義明顯(P＞0.05)。結果見表1。

表1 益氣活血湯對缺血心肌大鼠Ras、ERKl、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達平均光密度值的比較 （±s，n=5）

表1 益氣活血湯對缺血心肌大鼠Ras、ERKl、p-ERK1 和C-Raf-1 蛋白表達平均光密度值的比較 （±s，n=5）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與小劑量組相比◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組 別正常組假手術組模型組小劑量組倍他樂克組大劑量組C-Raf-1 0.2100±0.0123△△0.2460±0.0182△0.2920±0.0084 0.3020±0.0217 0.3820±0.0192△△◇◇0.4740±0.0573△◇ERK1 0.2840±0.0623△0.3940±0.0230△0.4480±0.0205 0.6160±0.0744△1.2060±0.3074△0.8840±0.1092△△◇p-ERK1 0.2140±0.0365△0.2740±0.0114△0.3160±0.0152 0.3540±0.0152△0.5880±0.1145△0.4100±0.0255△△◇Ras 0.2320±0.0286△0.2660±0.0089△0.3000±0.0123 0.3260±0.0114 0.4000±0.0187△△◇◇0.5120±0.0687△◇光密度值

3 討論

ERK/MAPK 途徑是最重要的細胞增殖信號轉導途徑，可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等，特別是在血管生成方面作用的研究越來越清晰。 研究發現通過阻斷ERK/MAPK 此通路，可以在一定程度上抑制宮頸癌細胞的生長，抑制宮頸癌的血管的生成[4]，在心肌梗死方面， 可能通過升高ERK1/2 的活性促進心肌梗死后早期的細胞增殖分化, 并在此后促進梗死細胞的血管再生[5]。

Ras/Raf/MEK/ERK 信號級聯通路是ERK/MAPK 途徑上重要的信號轉導通路之一。 Ras/Raf/MEK/ERK 信號級聯通路中，Ras 具有啟動因子的作用，活化的Ras 作為重要的信號轉導分子，參與了血管生成的發生、發展過程[6]。 Raf-1 是Ras 的主要靶蛋白， 是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶， 又稱MAPKKK，是Ras／Raf／MEK／ERK1/2 信號通路中的重要因子，其N 端的氨基酸對信號轉導有抑制作用，當Ras活化后，Raf-1 與Ras 結合，Raf-1 被催化而激活，活化的Raf 結合并磷酸化另一種蛋白激酶MEK(MAPKinase Kinase，即MAPKK)，使其活化，MAPKK 又激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，從而完成Ras／Raf／MEK／MAPK 信號通路整個信號轉導過程[7]。 細胞外信號相關蛋白激酶（ERK）是MARK 族系成員之一，屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，ERK 分為ERKl 和ERK2，統稱為ERKl／2，磷酸化ERKl／2 才具有活性，ERKl／2 的活化是將信號從細胞膜表面受體轉導至核的關鍵。 研究顯示Ras／Raf／MEK／ERK1/2 信號通路與VEGFR、VEGF 的促血管生成作用關系密切[8]。

血管新生是一個多因素、 多機制的復雜過程，而中醫藥的多成分、多途徑、多靶點的作用特色可為“治療性血管新生”的研究與臨床應用有效結合。益氣活血法是中醫藥治療心腦血管疾病常用治法，在血管新生方面表現出特殊的研究價值。 大量研究也顯示， 益氣活血中藥可調節細胞信號轉導機制，啟動生長、增殖信號，調節血管生成，增強機體抗修復能力，從而治療血管生成異常的疾病[9-10]。 杜雪君等[11]通過利用益氣活血中藥人參三七作用于大鼠心肌缺血模型， 顯示人參三七組方可能通過促進Ras的表達， 從而激活下游的C-Raf-1 及ERKl／2 來促進血管新生， 為我們的研究提供了前期研究依據。本研究用益氣活血組方，由黨參、黃芪、丹參三味藥組成，方中黨參補氣健脾，黃芪補氣、振奮心氣，丹參活血化瘀，諸藥合用，共奏補益心氣、活血化瘀之功效，通過研究此方治療心肌缺血的作用，有助于探索益氣活血中藥組方在心肌缺血方面的療效及治療機制，為中藥于心血管領域的發展提供了更多微觀實驗證據。

本研究結果顯示， 各因子于造模后均較空白組、假手術組顯著增加，自身有一定的促血管生成的能力。 對用藥組的研究發現，雖然少數因子表現出小劑量與模型組間差異無統計學意義，但絕大多數都表現出了顯著差異，且大劑量均明顯高于小劑量組，而大劑量組與倍他樂克組之間，各因子均表現為組間差異不顯著。 由此可見使用益氣活血湯后， 提 高 了Ras 通 路 上 重 要 因 子Ras、C-Raf-1、ERKl、p-ERK1 的表達，且高劑量組均高于低劑量組的表達，表現出與陽性對照組貝他樂克相似的優勢及一定的用藥劑量趨勢，揭示了益氣活血湯可能是通過調控Ras 通路上重要因子的表達來促進缺血后心肌的血管生成，抑制心肌缺血的損傷。

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