新疆紫草石油醚提取物對小鼠生殖組織形態及其臟器指數的影響

戴 冰，曹璐婷，肖子曾*，吳沁璇，曾呈茜，楊夢琳，張嘉倪

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst]為2010 版《中華人民共和國藥典》收載的紫草品種之一。 味甘、咸，性寒，歸心、肝經，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑等功效，是臨床常用的中藥[1]。 現代藥理研究發現新疆紫草具有良好的抗早孕、 抗生育作用，課題組前期研究發現，新疆紫草石油醚提取物是其抗生育作用的藥效部位[2]，但對其抗生育的毒性研究少有報道。 故通過開展對新疆軟紫草石油醚提取物的蓄積毒性試驗研究，對促進新疆紫草作為抗生育新藥的研發，確保其在育齡婦女用藥安全得以逐步實現，豐富、發展中藥妊娠用藥禁忌理論提供一定的實驗依據。

1 材料

1.1 受試物

新疆紫草 （購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，批號1307220462；經湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科檢驗鑒定為新疆紫草。

1.2 試驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，健康適齡，體質量18～22 g，共40 只，SPF 級，購自湖南中醫藥大學，許可證號：SCXK（湘）2013-0004；飼養處及試驗地：湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室。

1.3 主要儀器與試劑

RE-52A 旋轉蒸發儀 (上海亞榮生化儀器廠)；LEICA DM LB2 型雙目顯微鏡(德國LEICA 公司)；Shandon325 型石蠟切片機(英國Shandon 公司)；Motic B5 顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團公司)。

2 方法

2.1 新疆紫草石油醚提取物的制備[3]

稱取3 kg 新疆紫草50 ℃干燥6 h 后粉碎。 將新疆紫草粉末平均分三份（每份1 kg）于滲漉筒中，加10 倍體積石油醚，浸泡12 h，以2 mL/min 的流速滲漉提取一個月，富集提取液，減壓回收溶劑。 濃縮液揮干溶劑后稱重，計算每份固形物得率（相對于生藥材），分別為2.75%、2.68%、2.63%，平均固形物得率為2.69%。 動物試驗前以4%吐溫-80 助溶，50 ℃水浴加熱攪拌配制成混懸液備用。

2.2 蓄積毒性試驗及蓄積系數計算

取昆明種小鼠40 只，雌雄各半，采用20 d 劑量遞增蓄積毒性試驗法[4]，將小鼠隨機分為對照組和試驗組，每組20 只。 以10 mL/kg 鼠重灌胃，對照組給以4%吐溫-80 水溶液，試驗組小鼠給以配制的新疆紫草石油醚提取物混懸液， 以4 d 為一周期，初始給藥劑量為0.1 倍LD50（LD50按課題組急性毒性試驗所得數據3.48 g/kg 計算），1.5 倍遞增量每期遞增， 連續給藥到小鼠累積死亡一半時結束試驗，共計17 d。計算累積給藥劑量以及蓄積系數K=LD50(n)／LD50。

2.3 臟器指數測定及生殖器官病理觀察

進行毒性試驗后，待解剖小鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。解剖雄性小鼠取睪丸，雌雄小鼠取卵巢和子宮，精密電子天平稱取各臟器質量后于10%甲醛溶液中固定。 計算臟器指數，即臟器(mg)與活體體質量(g)之比。 采集的組織經過常規脫水、石蠟包埋、切片、烘烤、脫蠟、復水、HE 染色后光學顯微鏡下觀察。

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 新疆紫草石油醚提取物小鼠蓄積毒性試驗結果

給藥第17 天小鼠累積死亡總只數達到10 只，累積給藥劑量為13.08 g/kg， 相當于生藥材486.25 g/kg，蓄積系數K=3.76，根據蓄積毒性評價標準[5]，當K≥5 時，為弱蓄積性；當3≤K＜5 時，為中等蓄積性；當1≤K＜3 時，為強蓄積性。 結果表明新疆紫草石油醚提取物為中等蓄積毒性。

3.2 新疆紫草石油醚提取物對小鼠生殖器官臟器指數的影響

試驗組雄性小鼠睪丸指數與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），而試驗組雌性小鼠卵巢和子宮指數與對照組比均差異具有統計學意義 （P＜0.05），表明長期灌胃新疆紫草石油醚提取物對雄性小鼠睪丸組織無蓄積毒性影響，但可減輕雌性小鼠卵巢和子宮質量。 結果見表1。

表1 新疆紫草石油醚提取物對小鼠生殖器官臟器指數的影響 （n=10，±s）

表1 新疆紫草石油醚提取物對小鼠生殖器官臟器指數的影響 （n=10，±s）

注：與對照組比較*P＜0.05。

組 別對照組試驗組給藥劑量（g/kg）—13.08睪丸指數（對）6.60±1.00 7.21±0.83卵巢指數（對）0.94±0.12 0.81±0.11*子宮指數3.49±0.23 3.14±0.28*

3.3 新疆紫草石油醚提取物對小鼠生殖器官組織形態的影響

對照組雄性小鼠睪丸生精小管內細胞排列緊密，可見精原細胞、精母細胞以及大量精子細胞位于生精小管腔面，精子排列有序，睪丸間質細胞完好。 與對照組相比試驗組雄性小鼠睪丸病理組織觀察無明顯病變。

對照組雌性小鼠卵巢內各級卵泡細胞生長發育正常，輪廓清晰，初級卵母細胞核大而圓，可見少量閉鎖卵泡。 小鼠子宮大多處在增生期或分泌期，腺體排列密集，內膜較厚，組織細胞結構正常。 與對照組相比試驗組小鼠卵巢內各級卵泡細胞，卵母細胞發育正常，未發現細胞結構異常的病變，但閉鎖卵泡數目明顯增加， 小鼠子宮大多處于增生前期，腺體較少，內膜相對對照組較薄，組織細胞結構基本正常。 表明新疆紫草石油醚提取物對試驗組小鼠卵泡和子宮發育有一定影響，但對其細胞結構均無病理性損傷。 結果見第72 頁彩圖圖1～3。

4 討論

石油醚是提取新疆紫草脂溶性萘醌類成分的主要溶劑，其揮發性強，極性較低；且由于新疆紫草萘醌類成分是一類天然色素，高溫下容易變性或者分解。 因此本試驗根據前期對新疆紫草石油醚提取工藝的考察結果[6]，采用石油醚滲漉法冷浸提取該類成分，制得新疆紫草石油醚提取物，發現其得率較高且穩定。 同時還由于該提取物不溶于水，故在進行動物試驗給藥時，用4%吐溫-80 助溶量，水浴加熱攪拌配制成混懸液給藥。

臟器指數反映藥物對臟器的影響，是初步的毒性判斷。 該指數增加表示臟器有充血、水腫、增生、肥大等變化，指數下降表示臟器萎縮、退行性變化等[5]。 臟器指數的比較結果在一定程度上可說明藥物毒性作用的影響程度， 支持或印證病理檢查結果。 本試驗發現新疆紫草石油醚提取物為中等蓄積毒性，可降低雌性小鼠卵巢指數和子宮指數（卵巢和子宮質量）， 但對雌性小鼠卵巢和子宮組織形態無毒性損害，其細胞結構基本正常；表明該提取物可能導致雌性小鼠生殖組織的生長發育受到抑制，從而起到抗生育作用。 這與戴德英，羅學婭發現紫草在抗生育藥理作用中可能使雌性小鼠的卵巢和子宮質量下降，但對組織并無損害作用，其抑制作用是可逆的報道一致[6-7]。 究其原因可能與新疆紫草石油醚提取物干擾垂體對卵巢的調節作用，降低雌孕激素水平[8-9]，抑制小鼠卵巢內卵泡的成熟以及子宮內性腺的發育，使得閉鎖卵泡數目增多，子宮內膜壁變薄，從而導致卵巢和子宮的質量減輕有關。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：320.

[2]戴 冰，鄒雙華.新疆紫草系統溶劑法提取分離部位的抗生育作用研究[J].中藥材，2007，27(9)：1 120-1 122.

[3]沈建忠.動物毒理學[M].北京：中國農業出版社，2002：83-102.

[4]戴 冰，周新蓓，尹愛武，等.新疆紫草四種溶媒系統提取物紫草素含量測定及急性毒性的試驗研究[J].中國中醫藥科技，2005，12(3)：168-169.

[5]石東霞，楊 帆，殷中瓊，等.印楝油對小鼠的急性毒性試驗和蓄積毒性研究[J].中國獸醫科學，2010，40（3）：317-320.

[6]戴德英，鐘 以.中醫藥和避孕抗生育[J].上海中醫藥雜志，1981，15(5)：3-5.

[7]羅學婭，李明輝，呂 莉.紫草的藥理作用與應用研究進展[J].大連大學學報，2004，25(2)：80-83.

[8]馬保華，邴魯軍，王浙民.中藥紫草抗生育作用的研究[J].山東醫科大學學報，1993，31(1)：35.

[9]王 薇，李萍萍.紫草提取物對MCF-7 細胞及小鼠雌孕激素水平的影響[J].中國中藥雜志，2003，28(11)：1 062-1 067.